论文题目: 表达PRRSV GP5蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫效力的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 田志军
导师: 李一经,童光志
关键词: 重组伪狂犬病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,免疫效力
文献来源: 东北农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起,主要表现为妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎,仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病,死亡率增加,饲料报酬率降低。该病传播速度极快,是危害我国养猪业的一个重要传染病。疫苗免疫是控制该病发生的一个有效办法,但目前现有疫苗存在许多不足,如PRRSV 灭活疫苗免疫剂量大,接种次数多,不能激发黏膜免疫,保护效果不确实;弱毒疫苗虽然可以形成有效的临床保护,但和灭活疫苗一样不能阻止野毒感染,且存在着散毒和毒力返强之忧。所以利用生物技术手段开发能够激发黏膜免疫并能通过血清学方法区分野毒感染的安全和有效的新型PRRS 疫苗,来控制在我国日益泛滥的PRRS,是广大养猪企业的迫切需要。PRRSV 是单股正链RNA 病毒,属于尼多病毒目动脉炎病毒科,囊膜糖蛋白GP5 是PRRSV 产生中和抗体的主要靶抗原,PRRSV 自然感染动物血清中的中和抗体主要针对的就是GP5,据推测GP5 基因有一个由40 个氨基酸残基组成的区域,该区域有数个N 连接糖基化位点,PRRSV 的线形中和表位就预测在该区域。用含编码GP5 基因的质粒进行DNA 免疫,可使接种猪产生抗GP5 的特异性中和抗体,接种猪免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变,并使间质性肺炎和支气管肺炎明显减轻。由此可见GP5 基因是构建PRRS 基因疫苗和亚单位疫苗首选目的基因。本研究将CMV 启动子控制下的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH 1a 株GP5 基因和SV40 启动子控制下的LacZ 基因表达盒插入到伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)通用转移载体pBdTK-Uni 中,构建了含目的基因和报告基因的转移载体pGP5-LacZ,将pGP5-LacZ 与呈gE?表型的伪狂犬病弱毒疫苗Bartha-K61 株基因组DNA,通过脂质体法共转染Vero 细胞,经过10 代蓝斑筛选、蚀斑纯化和PCR 鉴定获得了一株稳定表达PRRSV GP5的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV-GP5。经生长动力学、表达动力学和间接免疫荧光试验证实,rPRV-GP5 感染细胞15 小时GP5 蛋白即可被Western blot 方法在感染的细胞中检测到,而在释放到上清中的病毒粒子上未检测到GP5,rPRV-GP5 感染细胞可以用PRRSV 特异抗体检测到胞浆荧光,证实表达的蛋白主要分泌到感染细胞的胞浆中或细胞膜上而不存在于病毒粒子表面,且表达蛋白的抗原性与亲本病毒相似。rPRV-GP5 在Vero、Marc-145、IBRS2 和CEF 细胞上毒价和细胞病变与亲本毒Bartha-K61 比较无显著差异。对第30 代rPRV-GP5 的GP5 基因进行序列分析和表达检测,表明rPRV-GP5 在传代过程中遗传性状稳定。10 只PRV 中和抗体为阴性,体重17~30kg 的5~6 月龄健康绵羊,随机分3 组:第I 组(3 只)为rPRV-GP5 安检组,每只肌注接种108.0 PFU;第II 组(4 只)为rPRV-GP5 效检组,每只肌注接种106.0 PFU;第III 组(3 只)为非接种对照组。接种后14 天,效检组和对照组每只绵羊肌注103LD50 PRV “双城系”猪源强毒S 株。结果表明rPRV-GP5 对PRV 敏感动物绵羊是安全的;对PRV 的强毒攻击具有100%的保护率,攻毒后第7 天和15 天采集鼻咽棉拭子,用gE 特异性引物未扩增到PRV gE 基因,说明rPRV-GP5 能阻止强毒的排毒。以上结果表明,rPRV-GP5 保留了其亲本毒Bartha-K61 株的安全性和免疫原性,其对伪狂犬病的免疫效力并
论文目录:
中文摘要
英文摘要
1 引言
1.1 伪狂犬病疫苗研究进展
1.1.1 伪狂犬病概述
1.1.2 伪狂犬病常规疫苗
1.1.3 伪狂犬病基因缺失疫苗
1.1.4 伪狂犬病活载体疫苗
1.2 猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展
1.2.1 猪繁殖与呼吸综合征概述
1.2.2 猪繁殖与呼吸综合征常规疫苗
1.2.3 猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗
1.2.4 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的研究进展
1.2.5 猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究的难点与展望
1.3 研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 细胞、毒株、血清和质粒
2.2 引物、试剂
2.3 主要仪器
2.4 转移载体的构建策略
2.5 毒价测定
2.6 PRV 病毒核酸提取
2.7 转染
2.8 重组病毒的筛选和纯化
2.9 PCR
2.10 间接免疫荧光试验
2.11 Western blot
2.12 病毒生长动力学和表达动力学试验
2.13 绵羊接种和攻毒试验设计
2.14 仔猪接种和攻毒试验设计
2.15 血清学实验
2.16 病理学检查
2.17 病毒血症的测定
2.18 现地母猪的免疫试验
3 结果
3.1 重组病毒的构建和鉴定
3.2 rPRV-GP5 生物学特性的分析
3.2.1 GP5 在Vero 细胞中的表达
3.2.2 rPRV-GP5 生长动力学和表达动力学分析
3.2.3 rPRV-GP5 与Bartha-K61 在不同细胞上毒价比较
3.2.4 rPRV-GP5 体外遗传稳定性
3.3 rPRV-GP5 对绵羊的安全和效力试验
3.3.1 rPRV-GP5 对绵羊和家兔的安全性
3.3.2 rPRV-GP5 对绵羊效力试验
3.4 rPRV-GP5 对仔猪的安全和效力试验
3.4.1 仔猪接种和攻毒后的临床表现
3.4.2 rPRV-GP5 接种猪的体液免疫应答
3.4.3 主要脏器的病理变化
3.4.4 攻毒后病毒粒子在猪主要脏器中的分布
3.4.5 攻毒后病毒血症持续期
3.5 rPRV-GP5 对现地母猪的保护
4 讨论
4.1 重组伪狂犬病毒的筛选
4.2 GP5 在重组伪狂犬病毒中的表达特性
4.3 GP5 基因插入对PRV 的影响
4.4 rPRV-GP5 接种猪对PRRSV 的免疫应答
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
发布时间: 2005-10-31
参考文献
- [1].CRISPR/Cas9技术在伪狂犬病毒研究中的应用[D]. 汤艳东.中国农业科学院2018
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- [3].伪狂犬病毒上海株PK～-缺失株及PK～-gG～-双缺失株的构建及免疫原性初步研究[D]. 黄伟坚.南京农业大学2006
- [4].伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗及VP22蛋白转导的免疫增强效应研究[D]. 肖少波.华中农业大学2004
- [5].伪狂犬病毒Ea株gD基因转基因细胞系的构建及其人工感染仔猪的病理学[D]. 石德时.华中农业大学2004
- [6].猪2型圆环病毒核酸疫苗及重组伪狂犬病毒二价基因工程疫苗的研究[D]. 宋云峰.华中农业大学2006
- [7].伪狂犬病毒LLT基因miRNA簇的功能研究[D]. 王昕.华中农业大学2017
- [8].弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究[D]. 聂浩.华中农业大学2010
- [9].PRV鲁A株的分离鉴定及表达EGFP和CSFV-E2的TK～-重组伪狂犬病毒的构建[D]. 范伟兴.南京农业大学2002
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