论文摘要
树突状细胞（DCs）分泌的exosomes是来源于内吞途径的小囊泡，表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和共刺激分子等，能够活化T细胞产生免疫应答，在抗肿瘤免疫治疗中有着诱人的前景。为了建立DCs分泌的exosomes（Dex）的制备方法，分析其生物学特性和在抗肿瘤免疫中的功能，本研究从正常人外周血单个核细胞中诱导未成熟DCs（imDC）并使其负载K562肿瘤细胞的抗原，然后用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导DCs成熟（mDCs），通过多次超速离心结合膜超滤的方法提取imDCs和mDCs分泌的exosomes。检测exosomes的粒径并通过电子显微镜分析exosomes的形态，Western blot法检测exosomes的表面分子。比较mDCs和imDCs分泌的exosomes引起的针对K562抗原特异性T细胞的增殖、CD69的上调、细胞因子IFN-γ的分泌及对肿瘤细胞杀伤能力。实验结果显示，制备的exosomes为碟状小囊泡，平均粒径为72.3nm，表达CD80、CD86、HLA-DR、FasL、CD54和MFG-E8（milk-fat globule-epidermal growth factor-factorⅧ）。与imDCs相比，mDCs分泌的exosomes的CD80表达较高而MFG-E8的表达较低，并且在体外mDCs分泌的exosomes能够更显著地引起特异性T细胞的增殖和免疫应答。体外在mDC存在的情况下，20μg／ml mDex可有效活化T细胞，T细胞增殖后吸光度值上升到0.5±0.01，激活T细胞的CD69上调并且有（13.40％±5.76）％T细胞扩增，（22.76±2.37）％的T细胞产生细胞因子IFN-γ，在效靶比为10∶1时对肿瘤细胞的杀伤率为（21.3±8.55）％。同时，为了进一步研究exosomes作用的分子机制，为exosomes肿瘤疫苗的改进和应用提供理论基础，我们利用制备好的exosomes研究其在DCs有无或DCs成熟状态不同的情况下，刺激T细胞增殖的能力，并且比较了异源exosomes与同源exosomes功能的差别；通过阻断实验，阻断imDCs分泌的exosomes上一些分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后，检测对exosomes免疫学功能的影响；采用共聚焦显微镜检测DCs对exosomes的吞噬作用，流式细胞仪检测阻断了exosomes表面分子对DCs吞噬exosomes作用的影响。结果发现：在无DCs存在或imDCs存在的情况下未成熟DCs分泌的exosomes（imDex）和成熟DCs分泌的exosomes（mDex）均不能有效地激活T细胞；不同促成熟因子（LPS、TNF-α、CpG、CD40L）诱导成熟的DCs分泌exosomes的数量无明显差别而功能上有显著差异；异源Dex在功能方面与同源Dex无差别，两者都是在mDCs辅助下才能刺激T细胞增殖；Dex表面分子CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83与其功能有关，阻断这些分子均能不同程度地抑制Dex对T细胞刺激的作用；通过共聚焦显微镜和流式细胞仪检测出CD54在Dex靶向及被DCs吞噬的过程中起很重要的作用。