一氧化氮对桃果实ETR1蛋白原核表达及李果实线粒体膜氧化损伤的影响

论文摘要

本文分为两部分,第一部分内容是对桃果实中的乙烯受体蛋白进行原核表达,并优化了蛋白表达条件,初步探索了NO对乙烯受体基因转录表达的影响;第二部分内容研究了一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响。克隆了与肥城桃成熟有关的乙烯受体ETR1基因片段,获得ETR1重组蛋白并优化ETR1的表达条件,为进一步研究ETR1功能并改善肥城桃贮运性能奠定基础。以肥城桃成熟果实总RNA反转录cDNA为模板,经PCR扩增到一条约2500 bp的特异片段,将该片段克隆到pEASY-T1上,经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切后,克隆到pET15b并转染Ecoli C43（DE3）,IPTG诱导表达ETR1重组蛋白并优化其表达条件。序列分析结果表明,该序列与GenBank中的AF124527的cDNA序列同源性99%,氨基酸序列同源性99%。诱导ETR1重组蛋白的优化条件为:大肠杆菌选用C43（DE3）,IPTG的终浓度为0.5 mmol·L-1,适宜诱导温度为30 oC,适宜诱导时间为8 h。在本实验优化的条件下,ETR1重组蛋白在大肠杆菌C43（DE3）中的成功表达,为ETR1的重组生产和对ETR1功能的体外研究提供了条件。随着NO浓度的增加,对ETR1基因表达的抑制作用也更加显著。分别用0、10、15、30μL·L-1 NO处理李果实,测定25℃贮藏13 d内果实呼吸速率、活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性、线粒体通透性转换孔开放程度、膜电位、膜流动性、细胞色素（Cyt） c/a的变化。与对照和其它NO处理相比,15μL·L-1 NO提高了果实中SOD、CAT和POD活性,有效减少了果实中氢过氧化物和超氧阴离子自由基等ROS的含量,抑制了线粒体通透性转换孔的开放,延缓了线粒体膜通透性的升高和Cyt c的释放,维持了较高的膜电位。随着浓度升高,30μL·L-1NO对线粒体膜的保护作用降低。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 一氧化氮
• 1.1.1 NO 在植物体内的产生
• 1.1.1.1 依赖于一氧化氮合成酶（NOS）的生成途径
• 1.1.1.2 依赖于硝酸还原酶（NR）的生成途径
• 1.1.1.3 非酶促的NO 生成途径
• 1.1.2 NO 在植物体内的调节作用
• 1.1.2.1 NO 介导脱落素诱导的气孔关闭
• 1.1.2.2 NO 与抗氧化酶的关系
• 1.1.2.3 NO 和乙烯的相互作用
• 1.2 乙烯
• 1.2.1 乙烯的生物合成
• 1.2.2 乙烯的生理效应
• 1.2.3 乙烯信号转导
• 1.2.3.1 乙烯反应突变体
• 1.2.3.2 乙烯信号转导模型
• 1.2.3.3 乙烯转导途径中各个因子的上下关系
• 1.2.4 乙烯受体的研究现状
• 1.2.4.1 乙烯受体家族
• 1.2.4.2 乙烯受体蛋白
• 1.3 线粒体
• 1.3.1 线粒体结构特点与功能
• 1.3.2 线粒体通透性转变孔
• 1.4 细胞色素c-凋亡起始因子
• 1.5 论文研究内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试材与试材处理
• 2.2 仪器与试剂
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 乙烯受体蛋白的原核表达及NO 对乙烯受体基因的影响
• 2.3.1.1 特异性引物设计
• 2.3.1.2 RNA 提取
• 2.3.1.3 总浓度测定
• 2.3.1.4 cDNA 第一链的合成
• 2.3.1.5 梯度PCR
• 2.3.1.6 回收目的DNA 片段
• 2.3.1.7 克隆载体的构建及鉴定
• 2.3.1.8 原核表达载体构建及鉴定
• 2.3.1.9 目的基因的诱导表达条件的优化及可溶性分析
• 2.3.1.10 含重组质粒的大肠杆菌的繁殖培养
• 2.3.1.11 大肠杆菌的破碎和目的蛋白的获得
• 2.3.1.12 ETR1 蛋白的组氨酸激酶活性
• 2.3.1.13 NO 乙烯受体基因的扩增的影响
• 2.3.2 一氧化氮对采后李果实线粒体膜氧化损伤的影响
• 2.3.2.1 果实呼吸速率
• 2.3.2.2 超氧自由基和氢过氧化物含量的测定
• 2.3.2.3 抗氧化酶活性测定
• 2.3.2.4 线粒体的提取和活性测定
• 2.3.2.5 线粒体膜通透性转换孔（MPTP）的测定
• 2.3.2.6 细胞色素Cyt c/a 测定
• 2.3.2.7 线粒体膜流动性检测
• 2.3.2.8 线粒体膜电位的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 乙烯受体的纯化与NO 对乙烯受体基因转录的影响
• 3.1.1 桃果实RNA 的完整性
• 3.1.2 RT-PCR
• 3.1.3 ETR1 基因的扩增
• 3.1.4 ETR1 基因的扩增及原核表达载体的构建
• 3.1.5 融合蛋白诱导表达条件优化体系的建立及蛋白可溶性分析
• 3.1.6 ETR1 蛋白的组氨酸激酶活性
• 3.1.7 NO 饱和溶液处理对基因表达的影响
• 3.2 一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响
• 3.2.1 NO 对果实呼吸速率、超氧阴离子和氢过氧化物含量的影响
• 3.2.2 NO 对SOD、CAT 和POD 活性的影响
• 3.2.3 线粒体膜变化
• 4 讨论
• 4.1 乙烯受体蛋白的原核表达及NO 对乙烯受体基因表达的影响
• 4.2 一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响
• 5 结论
• 6 创新之处
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录