嗜酸氧化亚铁硫杆菌适应与活化元素硫的分子机制研究

论文摘要

在生物浸出过程中,金属硫化矿在三价铁离子和质子作用下分解,可能产生元素硫累积,进而在金属硫化矿表面形成疏水元素硫层,阻碍金属离子的进一步浸出。浸矿环境中的嗜酸硫氧化细菌能有效消解和利用硫化矿分解过程中的元素硫,同时不断补充在浸出过程中消耗的质子。这表明硫生物氧化在生物浸出中扮演着十分重要的角色,研究和了解这种角色的作用机制、实现途径及其影响因素是十分必要的;另一方面,有关硫生物氧化的分子机制一直是硫生物氧化系统中的关键问题,至今未得到清晰的阐明。本论文旨在更进一步拓展对硫生物氧化过程的了解,研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）适应与活化元素硫的分子机制。研究工作主要包括如下三个方面:（1）嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氧化的环境适应性:通过研究几种常见阴离子（氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子和磷酸根离子等）对A.ferrooxidans生长和硫氧化活性的影响,揭示环境中阴离子对A.ferrooxidans生长和硫氧化活性影响的一般性规律。结果表明:一般情况下随着环境中阴离子浓度升高,表现出延缓或抑制细菌生长。但磷酸根离子对细菌的生长和硫氧化活性的抑制在浓度相当高的情况下才表现出来,100 mmol/L的磷酸根离子甚至对细菌的生长和硫氧化活性具有促进作用。正常环境下细菌体内参与细胞生理生化反应的蛋白质表达数量相对较多;在高浓度PO43-胁迫下细菌表达蛋白的总数量相对减少,但同时表达一些特异性蛋白来调整和适应对无机阴离子胁迫效应。通过比较研究A.ferrooxidans在元素硫和硫代硫酸盐中细胞形态和生长特性、元素硫在A.ferrooxidans作用前后表面性质变化、细菌自身细胞表面化学性质的变化、以及A.ferrooxidans对元素硫的吸附行为等,了解A.ferrooxidans在元素硫和硫代硫酸盐基质中的细菌细胞适应性。结果表明:细菌能够优先利用可溶性能源基质硫代硫酸盐,生长在硫代硫酸盐中的细菌呈细长形态且细胞浓度较高,细胞亲水性较强;而生长在元素硫中的细菌呈短而粗的形态。细胞表面分泌大量附属物或蛋白质,使元素硫表面的疏水性质改变为亲水性,便于细菌对元素硫的吸附,或者使细菌随机胶结和堆集在硫粒上,这种吸附与解吸附呈一种动态变化过程;同时,硫粒表面因细菌的作用而形成腐蚀小坑。（2）硫基质中嗜酸氧化亚铁硫杆菌胞外蛋白质组的初步研究:研究A.ferrooxidans特化细胞空间（胞外、细胞周质）蛋白质组学,更易于发现在特定功能区域内行驶特定功能的蛋白质。本论文建立了选择性分离和双向电泳展示A.ferrooxidans特化细胞空间蛋白质的方法体系,明确了具体实验参数。研究在亚铁和元素硫基质中的A.ferrooxidans胞外蛋白表达差异,鉴定和分析在元素硫基质中A.ferrooxidans胞外高表达蛋白质。通过对在元素硫基质中A.ferrooxidans胞外高表达蛋白质的鉴定和分析,发现除少数蛋白质（或多肽）有预测功能外,大部分都属于未知功能的蛋白（或多肽）。鉴定的已有功能预测的蛋白（或多肽）包括:接合转移的蛋白质（AFE1391:conjugal transfer protein）、吸附相关的菌毛蛋白（AFE2621:pilin,putative）、脂蛋白（AFE1847:lipoprotein,putative;AFE0982:vacJ lipoprotein）、多聚糖脱乙酰酶家族蛋白（AFE0927:polysaccharide deacetylase family protein）和丝氨酸/苏氨酸磷酸水解酶家族蛋白（AFE1932:Ser/Thr phosphoric acid hydrolasefamily proteins）。生物信息学分析还发现有6个功能未知胞外蛋白质序列中含有较高丰度的半胱氨酸残基,有四个多肽序列中含有CXXC功能模体。由此推测,在元素硫中A.ferrooxidans表达相对较高的胞外蛋白质（或多肽）,推测它们的功能与元素硫的吸附和活化相关。据此提出了多巯基胞外蛋白在元素硫吸附活化过程中可能的作用方式,但其具体功能还需要深入而细致的验证和分析。（3）分析与鉴定硫活化/氧化相关蛋白质和基因的特征:还原性谷胱苷肽在硫活化与氧化过程中发挥重要作用,通过对维持A.ferrooxidans细胞体内的还原性谷胱苷肽水平的谷胱苷肽还原酶（glutathionereductase,GR）基因进行克隆与原核表达,以及对表达产物进行酶学性质的研究,发现该独特的GR不仅能以NADPH为电子供体,也能以NADH作为电子供体将氧化性谷胱苷肽（GSSG）转变为还原性谷胱苷肽（GSH）;序列比对发现该酶NADPH结合模体中的一个保守精氨酸残基位点被天冬酰胺残基所取代。巯基蛋白参与细胞周质空间还原性硫化合物的氧化,二硫键形成蛋白对维持周质空间高水平游离巯基的存在、修复和维持二硫键的正确连接起着十分重要的作用。通过对A.ferrooxidans中二硫键形成蛋白基因dsbG进行克隆与原核表达,以及对表达产物的酶学性质的研究,发现表达产物有二硫键异构酶活性;点突变结果表明其催化模体CXXC中的C119和C122位点是二硫建异构酶活性所需的关键氨基酸残基。结合已有的研究结果和A.ferrooxidans全基因组基因信息,利用RT-PCR方法从转录水平上分别对A.ferrooxidans ATCC 23270基因组中可能编码硫酸盐-硫代硫酸盐结合蛋白基因sbp、膜结合硫代硫酸盐-辅酶Q氧化还原酶基因doxDA以及类硫氰酸酶基因p21等开放阅读框所在的基因座之间的联系进行了鉴定和分析,结果表明它们分别从属于预测的doxDA-1操纵子和doxDA-2操纵子。在此基础上,利用生物信息学的方法对doxDA操纵子的可能启动子序列也进行了预测和分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 金属硫化矿的生物浸出
• 1.2 元素硫的化学特性与生物浸出的关联性
• 1.3 嗜酸硫氧化细菌系统多样性
• 1.4 嗜酸硫氧化细菌对元素硫的生物化学氧化
• 1.4.1 硫的化学形态
• 1.4.2 嗜酸硫氧化细菌硫氧化系统的特点
• 1.5 本论文的研究目的和意义
• 1.6 本论文的主要研究内容
• 1.7 论文课题来源
• 第二章 典型阴离子对嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氧化表观活性的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株、培养基和培养条件
• 2.2.2 细菌在不同浓度阴离子溶液中生长行为的观察
• 2.2.3 A.ferrooxidans细胞总蛋白质的提取及双向电泳展示
• 2.3 结果与讨论
• 3^-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响'>2.3.1 不同浓度NO₃^-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响
• -对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响'>2.3.2 不同浓度Cl^-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响
• 4^2-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响'>2.3.3 不同浓度SO₄^2-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响
• 4^3-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响'>2.3.4 不同浓度PO₄^3-对A.ferrooxidans生长和硫氧化的影响
• 4^3-胁迫下A.ferrooxidans细胞总蛋白表达差异谱展示'>2.3.5 高浓度PO₄^3-胁迫下A.ferrooxidans细胞总蛋白表达差异谱展示
• 2.4 本章小结
• 第三章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌适应元素硫基质的细胞表面特性变化
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株、培养基和培养条件
• 3.2.2 硫的预处理
• 3.2.3 细菌在元素硫和硫代硫酸盐生长基质中生长行为的观察
• 3.2.4 硫粒和细菌表面亲疏水性测定
• 3.2.5 元素硫和细菌表面的傅里叶红外（FT-IR）光谱测定
• 3.3 结果与讨论
• 0和S₂O₃^2-生长基质中的生长曲线'>3.3.1 A.ferrooxidans在S⁰和S₂O₃^2-生长基质中的生长曲线
• 3.3.2 硫粒与细菌相互作用前后的亲疏水性差异分析
• 0和S₂O₃^2-中生长的细菌形态差异'>3.3.3 在S⁰和S₂O₃^2-中生长的细菌形态差异
• 3.3.4 硫粒与细菌相互作用的显微镜检分析
• 3.3.5 FT-IR光谱分析硫粒与细菌相互作用前后表面成分变化
• 3.4 本章小结
• 第四章 硫基质中嗜酸氧化亚铁硫杆菌特化空间蛋白质的分离与展示
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株、培养基和培养条件
• 4.2.2 A.ferrooxidans特化空间蛋白质的提取与分离
• 4.2.3 蛋白质双向电泳操作
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 A.ferrooxidans胞外蛋白质电泳展示
• 4.3.2 A.ferrooxidans细胞周质空间蛋白质电泳展示
• 4.4 本章小结
• 第五章 硫基质中嗜酸氧化亚铁硫杆菌胞外高表达蛋白质组的初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株、培养基和培养条件
• 5.2.2 胞外蛋白质表达差异实验的技术流程
• 5.2.3 不同能源基质生长的A.ferrooxidans胞外蛋白质的提取
• 5.2.4 A.ferrooxidans胞外蛋白质的傅里叶红外光谱测定
• 5.2.5 不同能源基质中生长的A.ferrooxidans胞外蛋白质差异展示
• 5.2.6 胶内酶解与质谱分析
• 5.2.7 数据库检索鉴定蛋白质
• 5.3 结果与讨论
• 0、S₂O₃^2-和Fe²⁺中生长的A.ferrooxidans细胞FT-IR光谱分析'>5.3.1 在S⁰、S₂O₃^2-和Fe²⁺中生长的A.ferrooxidans细胞FT-IR光谱分析
• 0、S₂O₃^2-和Fe²⁺中生长的A.ferrooxidans胞外物质FT-IR分析'>5.3.2 在S⁰、S₂O₃^2-和Fe²⁺中生长的A.ferrooxidans胞外物质FT-IR分析
• 2+和S⁰中生长的A.ferrooxidans胞外蛋白质的电泳展示'>5.3.3 在Fe²⁺和S⁰中生长的A.ferrooxidans胞外蛋白质的电泳展示
• 5.3.4 MALDI-TOF/TOF分析及数据库查询
• 5.3.5 在元素硫基质中生长的A.ferrooxidans胞外蛋白质的分类与分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌元素硫活化/氧化相关谷胱苷肽还原酶的表达与纯化及特征分析
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌株与生长条件
• 6.2.2 主要试剂及配制
• 6.2.3 DNA提取
• 6.2.4 引物和PCR扩增
• 6.2.5 表达载体的构建和SDS-PAGE检测
• 6.2.6 GR蛋白质的纯化
• 6.2.7 重组谷胱苷肽还原酶的分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 A.ferrooxidans中gr基因的克隆与表达载体的构建
• 6.3.2 表达产物的SDS-PAGE
• 6.3.3 重组GR融合蛋白质的活性检测
• 6.3.4 GR序列分析
• 6.4 本章小结
• 第七章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌元素硫活化/氧化相关二硫键形成蛋白的表达与纯化及特征分析
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 菌株与培养基
• 7.2.2 主要试剂及配制
• 7.2.3 DNA提取与质粒提取
• 7.2.4 引物和PCR扩增
• 7.2.5 表达载体的构建和SDS-PAGE检测
• 7.2.6 构建带有点突变位点的重组质粒
• 7.2.7 蛋白质的纯化
• 7.2.8 二硫键异构酶活性测试
• 7.2.9 DsbG蛋白质的分子建模
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 dsbG基因的克隆与表达载体构建
• 7.3.2 重组DsbG融合蛋白质以及突变DsbG融合蛋白质的纯化
• 7.3.3 DsbG二硫键异构酶活性测定
• 7.3.4 DsbG蛋白的结构模型
• 7.4 本章小节
• 第八章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氧化相关doxDA操纵子的鉴定与分析
• 8.1 引言
• 8.2 材料和方法
• 8.2.1 菌株、培养基和培养条件
• 8.2.2 细菌DNA和RNA提取以及cDNA合成
• 8.2.3 引物设计与PCR反应
• 8.2.4 序列分析
• 8.3 结果
• 8.3.1 doxDA-1和doxDA-2操纵子中开放阅读框的生物信息学分析
• 8.3.2 doxDA-1和doxDA-2操纵子中开放阅读框的共转录分析
• 8.3.3 doxDA-1和doxDA-2操纵子中启动子序列分析
• 8.4 讨论
• 8.5 小结
• 第九章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果