合浦珠母贝钙调素类似蛋白功能的研究

论文摘要

作为钙代谢的产物,珍珠和贝壳的形成机理一直是人们研究的热点。为进一步揭示贝类生物矿化机理,本研究以目前我国用于生产海水珍珠的主要贝类合浦珠母贝为研究材料,以本实验室已克隆出的新蛋白钙调素类似蛋白（calmodulin-like protein,CaLP）为研究对象,对CaLP在细胞水平上的功能进行了进一步的研究,并将其与本实验室已克隆出来的另一钙代谢相关蛋白钙调素（calmodulin,CaM）进行了比较。在对切壳修复这一特殊的生物矿化过程的研究中发现CaLP积极参与了新生贝壳的形成;在前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化的过程中,CaLP能够促进成骨细胞的分化和矿化过程。通过构建CaLP的缺失突变体证明CaLP末端的12个氨基酸在这个过程中发挥了重要作用。通过对体外培养的珍珠贝外套膜上皮细胞核质分离后进行的Western blot分析和免疫电镜研究发现,CaM和CaLP的亚细胞定位是截然不同的:CaM分布于外套膜上皮细胞的细胞核与细胞质中,而CaLP却仅分布于外套膜上皮细胞的细胞质中。对野生型CaLP及CaLP各种突变体的研究表明:CaLP末端12个氨基酸残基与C端的球形结构域共同保证了CaLP被隔离在细胞质中而不入核。为进一步研究CaLP各个结构域在蛋白相互作用中的功能,选取了细胞周期负调控蛋白p21作为与CaLP相互作用的对象,细胞中共表达CaLP与p21后免疫共沉淀实验证明:来源于合浦珠母贝的CaLP能够与p21相互作用,且CaLP的C端球形区域保证了CaLP与p21的相互作用。激光共聚焦实验还发现当p21过表达时能够引起CaLP从细胞质向细胞核的转移,通过生物信息学方法,免疫共沉淀实验和流式细胞分析表明,CaLP的139位酪氨酸残基存在着较高的磷酸化潜力且在CaLP的核质穿梭和蛋白相互作用中起到了重要的作用。对定位于不同部位的CaLP的磷酸化状态的分析表明:当在细胞中单独表达CaLP时,它以磷酸化形式存在,且磷酸化的位点发生在Y139上,CaLP因此定位于细胞质中;当共表达CaLP与p21时,p21的过表达引起CaLP发生去磷酸化,CaLP由细胞质穿梭入细胞核并与p21发生直接相互作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 生物矿化
• 1.1.1 生物矿化的概念
• 1.1.2 生物大分子与生物矿化
• 1.1.3 研究生物矿化的意义
• 1.2 钙调素与钙代谢
• 1.2.1 贝类生物矿化与钙代谢的关系
• 1.2.2 钙调素的结构
• 1.2.3 钙调素的磷酸化现象与功能
• 1.3 合浦珠母贝钙调素类似蛋白
• 1.3.1 钙调素类似蛋白与钙调素的序列比较
• 1.3.2 合浦珠母贝钙调素类似蛋白基因在不同组织中的表达分析
• 1.3.3 合浦珠母贝钙调素类似蛋白与钙调素靶蛋白谱的分析
• 1.4 细胞周期调控蛋白p21 与钙调素的相互作用
• 1.4.1 细胞周期及细胞周期正负调控蛋白
• 1.4.2 p21 的结构与性质
• 1.4.3 p21 与钙调素的相互作用及胞内定位
• 1.5 研究目的和意义
• 1.6 论文各部分的主要内容
• 第2章 合浦珠母贝钙调素类似蛋白在生物矿化中的作用及其与钙调素的区别
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 钙调素及钙调素类似蛋白多克隆抗体的制备与纯化
• 2.2.2 钙调素及钙调素类似蛋白多克隆抗体的特异性检测
• 2.2.3 贝壳切壳修复过程中钙调素及钙调素类似蛋白的表达分析
• 2.2.4 钙调素及钙调素类似蛋白对成骨细胞矿化的影响
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 钙调素及钙调素类似蛋白多克隆抗体制备纯化与特异性检测
• 2.3.2 壳修复过程中钙调素和钙调素类似蛋白的变化
• 2.3.3 过表达钙调素、钙调素类似蛋白及其缺失突变体对成骨细胞的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 钙调素的定位与功能的关系
• 2.4.2 分泌小泡（SV）与生物矿化的关系
• 2.4.3 OPN 与生物矿化的关系
• 2.5 本章小结
• 第3章 钙调素类似蛋白不同结构域在亚细胞定位中作用的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 钙调素及钙调素类似蛋白亚细胞定位的研究
• 3.2.2 钙调素及钙调素类似蛋白绿色荧光蛋白表达载体的构建
• 3.2.3 钙调素类似蛋白各种突变体绿色荧光蛋白表达载体的构建
• 3.2.4 细胞瞬时转染，细胞固定及激光共聚焦观察
• 3.2.5 Western blot 对各表达载体在293T 细胞中亚细胞定位的分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 钙调素与钙调素类似蛋白在外套膜上皮细胞中的分布
• 3.3.2 钙调素类似蛋白各突变体的cDNA 的克隆
• 3.3.3 钙调素类似蛋白各突变体在293T 细胞中的定位
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 钙调素类似蛋白结构域在蛋白相互作用中的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 p21 红色荧光蛋白表达载体的构建
• 4.2.2 293T 细胞的瞬时共转染
• 4.2.3 细胞固定及激光共聚焦观察
• 4.2.4 免疫共沉淀
• 4.2.5 ERK 活性的检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 p21 与合浦珠母贝钙调素和钙调素类似蛋白的相互作用分析
• 4.3.2 钙调素类似蛋白各结构域与p21 相互作用的分析
• 4.3.3 钙调素类似蛋白C 端球形结构域对ERK 活性影响的分析
• 4.3.4 p21 过表达引起钙调素类似蛋白的核质穿梭
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 p21 引起钙调素类似蛋白核质穿梭机理的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 生物信息学方法对钙调素类似蛋白磷酸化位点的预测
• 5.2.2 点突变钙调素类似蛋白磷酸化位点对核质穿梭和细胞周期的影响
• 5.2.3 钙调素类似蛋白不同磷酸化状态对蛋白相互作用的影响
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 Scansite2.0 对钙调素及钙调素类似蛋白磷酸化位点的预测
• 5.3.2 Y139 点突变对钙调素类似蛋白核质穿梭的影响
• 5.3.3 Y139 点突变对细胞周期影响的分析
• 5.3.4 细胞质中钙调素类似蛋白磷酸化状态的分析
• 5.3.5 不同磷酸化状态的钙调素类似蛋白与p21 相互作用的比较
• 5.3.6 钙调素类似蛋白的核质穿梭模式
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果