盐酸胍和脲诱导的牛胰岛素分子去折叠过程研究

论文摘要

本文综合利用荧光光谱、荧光相图、荧光探针、荧光淬灭和圆二色光谱技术对盐酸胍和脲诱导的牛胰岛素分子去折叠过程中三维空间结构、二级结构变化进行了检测,确定了中间态的存在和数目；在此基础上,以残余活性率的测定为实验依据建立理论模型并获得两个特征参数k和m,定量地描述了不同变性剂浓度下胰岛素分子各个构象态之间的过渡和分布；最后利用差示扫描量热法（DSC）测定了各个构象态的热稳定性,并在热不至引起胰岛素分子变性的温度范围内,利用反相色谱中分子保留机理测定各个构象态转变过程中热力学参数（焓变、熵变）的变化,从而对胰岛素分子构象态的热力学特征变化进行表征。本实验结果将为牛胰岛素分子折叠机制的研究提供一定的帮助。荧光光谱学实验结果显示：牛胰岛素分子在去折叠的过程中,荧光发射强度逐渐增强,疏水基团逐渐暴露；荧光相图和荧光探针实验表明：盐酸胍诱导的胰岛素分子去折叠过程存在两个折叠中间态（I1,I2）,分别出现在盐酸胍浓度约为1.5mol·L-1和6.0mol·L-1时,此过程遵循“四态模型”,并且第二中间态存在能与探针ANS结合的疏水区域。而脲诱导的牛胰岛素分子去折叠过程中脲浓度为2.5mol·L-1时存在一个部分折叠中间态,此过程符合“三态模型”,且该中间态存在能与ANS结合的疏水区域。圆二色谱检测结果显示,盐酸胍诱导过程中,第一中间态二级结构含量与天然态（N）相近,而第二中间态因失去大部分有序结构而变得松散。在脲诱导的去折叠过程中,牛胰岛素分子中间态约50%的二级结构解体。构象态过渡和分布理论模型推导结果：盐酸胍诱导的牛胰岛素分子去折叠过程中,一个牛胰岛素分子实现构象态之间转变需结合的变性剂平均分子数分别为：m1=1.01、m2=5.16、m3=0.63,各个结合过程的热力学平衡常数分别为：k1=2.97×10-1、k2=3.90×104、k3=1.47×10-1；在脲诱导的去折叠过程中平均结合脲分子数m1=2.18、m2=7.16；热力学平衡常数分别为k1=2.7×10-2、k2=1.01×10-6。m越大,同时k越小,表示转化过程不易进行,由此也可见各个构象态过渡过程的难易程度以及构象的稳定性。在已获得的m和k基础上绘制的各态分布图可定量描述牛胰岛素分子去折叠过程中各稳定构象态随溶液中脲和盐酸胍浓度的分布。经差示扫描量热（DSC）实验测得在盐酸胍诱导牛胰岛素分子去折叠过程中,天然态,第一、第二中间态,去折叠态的变性温度分别为89.1,91.9、72.1,68.5℃,其中N,I1的热稳定性较强,I2与U的稳定性差。各个构象态与C18柱的结合焓变分别为：-1.794,-2.070,-2.128,-2.095kJ·moL-1,ΔH0<0,结合过程中放出热量,I2释放热量最多,疏水作用最强；去折叠过程AS0*>0,混乱度增加,胰岛素分子有序性降低；AG0<0,去折叠过程为自发的过程,且AG0绝对值减小,自发性降低。牛胰岛素分子在脲诱导的去折叠过程中,I、U的变性温度分别为60.2,37.5℃,分子结构逐渐松散,热稳定性逐渐降低。另外,热力学特征参数AH0<0,AS0*>0,AG0<0,去折叠过程是分子结构逐渐从有序到无序转变的自发过程。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 蛋白质的构象变化
• 1.2 蛋白质的去折叠和重折叠
• 1.3 蛋白质折叠机理的热力学和动力学研究
• 1.4 蛋白质折叠过程中间体的研究
• 1.5 胰岛素结构研究的历程
• 1.6 本课题的意义
• 第二章 光谱学方法研究变性剂诱导牛胰岛素去折叠过程中的结构变化
• 2.1 荧光分析方法的理论基础
• 2.1.1 荧光激发光谱和荧光发射光谱
• 2.1.2 荧光相图法
• 2.1.3 荧光探针法
• 2.1.4 荧光淬灭法原理及数据分析
• 2.1.5 圆二色谱法测定蛋白质结构原理
• 2.2 实验仪器和试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 牛胰岛素去折叠反应过程
• 2.3.2 内源荧光光谱的测定
• 2.3.3 荧光相图
• 2.3.4 ANS发射光谱的测定
• 2.3.5 荧光淬灭
• 2.3.6 圆二色光谱法测定胰岛素去折叠过程中的二级结构
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 盐酸胍和脲诱导胰岛素分子去折叠过程的内源荧光发射光谱
• 2.4.2 荧光相图
• 2.4.3 荧光探针（ANS结合实验）
• 2.4.4 荧光淬灭
• 2.4.5 圆二色谱法研究胰岛素去折叠过程中的二级结构变化
• 第三章 盐酸胍和脲诱导牛胰岛素去折叠过程各个构象态的过渡与分布
• 3.1. 理论基础
• 3.2 牛胰岛素残余活性率的测定方法
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 标准曲线的绘制
• 3.3.2 牛胰岛素分子在不同变性剂浓度下的残余活性率r
• 3.3.3 牛胰岛素分子去折叠过程中构象态之间的过渡和分布
• 第四章 盐酸胍和脲诱导牛胰岛素去折叠过程的热力学变化研究
• 4.1 理论基础
• m'>4.1.1 差示扫描量热法测定胰岛素变性温度T_m
• 4.1.2 胰岛素去折叠过程中个稳定构象态热力学参数的测定
• 4.2 实验仪器与方法
• 4.3 实验结果与讨论
• 第五章 研究总结与展望
• 5.1 盐酸胍诱导牛胰岛素去折叠过程总结
• 5.2 脲诱导牛胰岛素去折叠过程总结
• 5.3 展望
• 参考文献
• 致谢