论文摘要
目的：1．通过体外分离、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），探讨其体外分离、纯化和培养的最佳条件；2．研究大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力与传代次数的关系；3．通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs体外分离和纯化的较好方法；4．用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）生物支架及骨髓间充质干细胞，构建组织工程化脂肪组织。方法：1．分别采用贴壁筛选法和密度梯度离心法分离和纯化骨髓间充质干细胞，并以不同的接种密度、不同的换液时间及不同的血清浓度检测细胞的生长情况，计算细胞的集落形成率、和细胞周期；2．采用全骨髓培养法，分离骨髓间充质干细胞，加含有地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1甲基黄嘌呤、吲哚美辛诱导剂的培养液进行诱导，诱导第10天进行细胞形态学观察和油红0染色鉴定，并进行光密度值测定；3．应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs，用第三代MSCs进行成脂诱导，以比较两种方法所获MSCs的成脂分化能力：4．将雄性大鼠骨髓间充质干细胞接种于PLGA支架上，向脂肪方向诱导培养1周，扫描电镜观察细胞在支架上的生长及黏附情况，同时，将细胞-支架复合体异体移值，取材观察其成脂情况，并使用原位杂交技术鉴定是否为植入细胞。结果：1．密度梯度离心法所分离细胞纯度高于贴壁筛选法，在以1×106cells／ml的浓度接种，含12％胎牛血清的MEM培养基中，37℃，5％CO2细胞培养箱中细胞生长状况良好，细胞贴壁呈现纤维状生长；2．随着传代次数增加，油红0染色细胞计数值与光密度值均下降；3．密度梯度离心法所获MSCs纯度高，呈纺缍形或小三角形，增殖快，约7～10天融合；而贴壁筛选法分离的原代细胞中红细胞、破骨细胞等杂质细胞较多，增殖速度相对较慢，且经数次传代仍有较多杂质细胞存在，经成脂诱导后，两种方法所获MSCs表现出相似的成脂能力，油红0染色细胞计数值与光密度值比较两组无显著差异（P值＞0.05）；4．生物支架上大量成脂分化细胞呈簇状生长，1个月时可见脂肪组织形成，3个月时脂肪组织成熟。结论：1．采用密度梯度离心法体外分离纯化MSCs，在适宜的培养条件下，生长状态良好，增殖速度快；2．大鼠MSCs成脂能力随传代次数增加而降低；3．密度梯度离心法是体外分离和纯化MSCs较好的方法，所获细胞增殖活性高，与贴壁筛选法所获MSCs具有相似的成脂分化能力；4．PLGA生物支架是一种理想的生物可降解支架，骨髓间充质干细胞接种于PLGA生物支架可构建组织工程化脂肪再造的研究。