Pseudomonas putida ZWL73降解3-羟基苯甲酸途径的研究

论文摘要

一株4-氯硝基苯（4-CNB） 的完全降解菌Pseudomonas putida ZWL73能利用3-羟基苯甲酸（3-HBA） 为唯一碳源和能源进行生长,而且ZWL73 在对3-HBA降解的过程中,有中间产物龙胆酸的生成;酶学分析的分光光度法证实,ZWL73通过依赖于还原型谷胱甘肽（GSH）的龙胆酸途径代谢3-HBA,并且该途径的酶需要经过3-HBA 或龙胆酸的诱导。ZWL73 降解3-HBA 的3-HBA-6-单氧酶编码基因被成功克隆、表达并进行了功能鉴定及活性测定。序列比对分析表明, ZWL73和Klebsiella pneumoniae M5a1 中的3-HBA-6-单加氧酶基因表现出了很高的相似性。此外,Pseudomonas putida ZWL73 除了以3-HBA,4-CNB 作为生长底物外,还能利用龙胆酸、邻苯二酚、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸等作为唯一碳源和能源生长。以不同生长底物诱导的ZWL73 所制备的粗酶对相应的底物都表现出了明显的催化活性。

论文目录

• 第一章 引言
• 1 环境污染与芳香烃污染
• 2 芳香烃化合物的微生物降解
• 3 微生物降解芳香烃化合物的基本机制和加氧酶
• 4 微生物降解芳烃化合物的基本途径
• 5 本研究的背景,目的和意义
• 第二章 Pseudomonas putida ZWL73 对3-羟基苯甲酸（3-HBA）等多种芳烃化合物降解的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品与试剂
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.1.4 培养基与缓冲液
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养条件
• 1.2.2 生长实验
• 1.2.3 细胞粗提物（粗酶）的制备
• 1.2.4 蛋白浓度测定
• 1.2.5 酶活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 Pseudomonas putida ZWL73 对3-羟基苯甲酸（3-HBA）和龙胆酸的代谢
• 2.2 Pseudomonas putida ZWL73 对4-氯硝基苯（4-CNB）的降解
• 2.3 Pseudomonas putida ZWL73 对邻苯二酚,原儿茶酸及4-羟基苯甲酸（4-HBA）的降解
• 3 讨论
• 第三章 3-羟基苯甲酸-6-单加氧酶基因的克隆与表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 工具酶和试剂
• 1.1.4 仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 质粒提取
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 菌落PCR
• 1.2.4 PCR 产物的加尾反应及纯化
• 1.2.5 重组质粒的构建
• 1.2.6 阳性克隆的验证
• 1.2.7 E.coli Rosetta（pZWXC5）的诱导表达及SDS-PAGE
• 1.2.8 粗酶的制备及蛋白浓度测定
• 1.2.9 显色反应及酶活性测定
• 1.2.10 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 3-HBA-6-单加氧酶基因的克隆
• 2.2 3-HBA-6-单加氧酶活性分析
• 2.3 3-HBA-6-单加氧酶的诱导表达
• 2.4 序列分析
• 3 讨论
• 4 小结及下一步工作设想
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢