论文摘要
目的研究胰岛素样生长因子-II（IGF-II）对体外培养的滋养层细胞迁移和侵袭作用的影响。方法一、人绒毛膜滋养层细胞的纯化培养。从6例妊娠6～8周患者人工流产的绒毛组织中获取滋养层细胞,用percoll液密度梯度进行分离纯化培养,种植在预先包被matrigel （matrigel:DMEM=1:2）的细胞培养瓶中,以获得高纯度的符合实验需要的滋养层细胞。二、胰岛素样生长因子II对滋养层细胞迁移作用的影响。将滋养细胞接种于包被matrigel的24孔板中,每例接种10孔,待细胞长满后,用100μL枪头在每孔中间划一竖线,用PBS液清洗3遍后更换为含1%FBS的培养液,其中分别含IGF-II浓度为0μg /L,10.5μg /L,26.5μg /L,52.5μg /L,112.5μg /L。分别在6,12,24小时测定竖线的间距,每一固定位置的距离减去初始时同一位置的距离便为在此时间段内细胞迁移的距离。利用划痕实验,每一浓度各加两孔,划线后,在每一孔下划三道横线以固定每次测量的位置。测距后放入37℃, 5%CO2的培养箱中培养,分别在6,12,24小时测定竖线的间距,每一固定位置的距离减去初始时同一位置的距离便为在此时间段内细胞迁移的距离。数据分析分为两组:剂量依赖性分析和时间依赖性分析。三.胰岛素样生长因子Π对滋养层细胞侵袭作用的影响。参考Sato Y建立的方法[8]并加以改进。在Transwell板（8微米孔径、6.4mm膜直径）滤膜表面包被matrigel 100微升（matrigel:DMEM=1:6）,在37℃, 5%CO2的培养箱中放置5个小时。使用前2小时加入37℃预温的DMEM高糖培养液100微升水化。上室加入100微升滋养细胞悬液（1%FBS的DMEM高糖培养液调整细胞密度为6×105个/m1）,并分别加入IGF-II至终浓度为0μg/L, 10.5μg/L, 26.5μg/L, 52.5μg/L, 112.5μg/L;下室加入600微升含5%FBS的DMEM高糖培养液,37℃、5%CO2培养箱中孵育,每一浓度加两个孔。实验分为两大组:①剂量依赖性分析。分为5组:对照组,不加IGF-II;终浓度10.5μg/LIGF-II组;终浓度26.5μg/LIGF-II组;终浓度52.5μg/LIGF-II组;终浓度112.5μg/LIGF-II组。加入不同浓度的IGF-II培养48h。②时间依赖性分析。分为4组:12h组、24h组、48h组、72h组。加入终浓度为52.5μg/LIGF-II,分别培养12h、24h、48h、72h。测定迁移至下表面的细胞数目以统计分析药物对滋养细胞迁移和侵袭力的影响。结果一、用percoll液密度梯度进行分离纯化培养,种植在预先包被matrigel-（matrigel:DMEM=1:2）的细胞培养瓶中的滋养层细胞纯度可达90%以上。二,胰岛素样生长因子II对绒毛滋养细胞迁移作用的影响。实验结果表明,IGF-II可明显促进滋养细胞的迁移,并且,随着浓度和时间的增加其促进滋养细胞的迁移能力增强。与对照组相比,各个浓度均显著促进细胞的迁移性,且各组间均有显著性差异, 52.5μg/L与112.5μg/L之间无显著性差异.在各浓度组,随着时间的延长其促进细胞迁移力增加,且各组时间段均有显著性差异.三,胰岛素样生长因子II对绒毛滋养细胞侵袭作用的影响。①剂量依赖性分析:实验证实,IGF-II可明显促进滋养细胞的侵袭力,在相同的时间里,随着浓度的增加而增加,与对照组相比,各个浓度均显著促进细胞的侵袭性,且各组间均有显著性差异, 52.5μg/L与112.5μg/L之间无显著性差异.②时间依赖性分析。加入终浓度为52.5μg/LIGF-II,在12,24,48,72小时分别测定侵袭至Transwell板下表面的细胞数目,随着时间的延长其促进细胞侵袭力增加,12,24,48小时各组间有显著性差异,48与72小时无显著性差异.由此可知,IGF-II对滋养细胞的侵袭力有浓度和时间依赖性。实验重复2次结论一、用percoll液密度梯度进行分离纯化培养,种植在预先包被matrigel-（matrigel:DMEM=1:2）的细胞培养瓶可获得纯度较高﹑合乎试验要求的滋养层细胞。二、IGF-II能显著促进滋养层细胞的迁移力,且这种迁移力具有时间和剂量依赖性,52.5μg/LIGF-II培养12小时达最佳量效反应。三、IGF-II能显著促进滋养层细胞的侵袭力,且这种侵袭力具有时间和剂量依赖性,52.5μg/LIGF-II培养48小时达最佳量效反应。
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