论文摘要
目的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种侵犯多系统的自身免疫性疾病,其特征为体内大量自身抗体的产生和免疫复合物的沉积,常累及肾脏引起不同程度肾实质和肾间质损害,其过程涉及多种炎性介质和细胞间复杂的相互作用。趋化因子对特异白细胞的趋化和功能活化是启动与自身免疫反应有关的病变的关键步骤之一。巨噬细胞衍生趋化因子(macrophage-derived chemokine, MDC)作为Th2型CC亚类趋化因子能够引起树突状细胞、单核细胞和T细胞尤其是Th2细胞的趋化移动。MDC与CCR4受体特异性结合,与自身免疫性疾病发病和进展有密切的关系。为了评估MDC在系统性红斑狼疮发病中的和作用,我们对SLE患者血浆MDC含量进行了检测和分析。有研究发现狼疮性肾炎病人肾组织中可见大量CD4+T细胞和单核巨噬细胞浸润,并有高水平的CCR4受体表达,提示其配体MDC和胸腺和活化调节因子(thymus and activation-regulated chemokine, TARC)可能也在LN病变过程中具有重要作用。在对于抗肾小球基底膜肾炎小鼠模型的研究中,MDC抗体的应用减少了肾组织中单核细胞的浸润,并明显地缓解了新月体病变的产生。我们利用SLE动物模型MRL/lpr小鼠,通过中和反应特异性阻断MDC活性,观察小鼠肾组织MDC和单核细胞分布及组织损伤的变化情况,检测MDC、TARC及CCR4受体mRNA和蛋白在组织中的表达,从而对SLE伴有肾脏损害时MDC在疾病进程中的地位和作用进行更加深入的研究并初步探讨MDC抗体在狼疮肾损害治疗中的价值和作用机制。方法1、ELISA法检测血浆MDC水平分别选择SLE患者初治组26例、经治组20例,类风湿组患者16例,正常对照组16例。患者于清晨空腹采抗凝血2毫升离心处理后用于ELISA检测,建立标准曲线和空白对照管,待测品孔中每孔各加入待测样品100ul,按顺序加入一抗工作液、酶标抗体工作液、底物工作液和终止液,酶标仪492nm处测吸光度值,绘制标准曲线,计算MDC浓度值。2、临床资料的采集收集整理患者的临床及实验室检查资料、分析初治组26例患者中15例肾活检病理分型结果并按SLEDAI评分标准对每例SLE病人进行评分。3、动物标本的采集8周龄MRL/lpr小鼠8只,按照随机数表分成两组,白12周起分别给予300μl MDC抗体和PBS,隔日一次尾静脉注射,8周龄BALB/c小鼠4只作为对照,自12周龄起给予同体积PBS。分别于8周12周和16周采用代谢笼收集小鼠24小时尿量并用眶后静脉丛采血法采集血样。于16周龄脊髓横断法处死小鼠,取出一侧肾脏组织,用福尔马林固定后行组织病理学检查,另一侧肾组织用于RNA和蛋白提取。4、肾组织常规病理学分析福尔马林固定的小鼠肾脏组织脱水、石蜡包埋、常规组织切片,经HE和PAS染色,400×高倍视野光镜下观察肾小球、肾小管病理变化。5、MDC和CD68免疫组织化学染色切片脱蜡后正常山羊血清封闭20min,加1:100稀释的鼠抗鼠MDC/1:200兔抗鼠CD68,37℃孵育1小时,生物素化山羊抗鼠IgG/山羊抗兔IgG,37℃孵育20min,过氧化物酶标记的链酶亲和素工作液孵育20min, DAB染色,苏木素复染。400倍光镜下摄取图像并随机对选取视野内MDC和CD68免疫组化阳性信号进行图像分析,计算表达强度和细胞数。6、RT-PCR法检测小鼠肾组织MDC、TARC和CCR4mRNA表达Trizol试剂提取总RNA,取1μg样品RNA构建反转录体系合成cDNA。取逆转录产物进行常规PCR扩增。电泳结果用凝胶成像分析软件分析,记录每条DNA扩增带的灰度值,将每一个目的DNA扩增片段的灰度值与相应的内对照β-actin扩增片段灰度值的比值作为每一个目的基因mRNA的半定量指标。7、Western免疫印迹法检测小鼠肾组织MDC、TARC和CCR4蛋白表达组织剪碎后加入配好的组织裂解液,匀浆机制成匀浆。12000rpm,4℃离心取上清用lowry法对蛋白进行定量。每份上清液取20μl加样,经SDS-PAGE凝胶进行蛋白分离后,转移至硝酸纤维素膜上,室温下封闭缓冲液封闭2小时,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1小时。用碱性磷酸酶显色法显示蛋白条带,凝胶图像分析软件分析。8、统计学分析统计结果以x±s表示,应用SPSS11.5软件对数据进行Mann-Whitney检验,Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon秩和检验、Spearman等级相关和Pearson相关系数分析,p<0.05为有统计学意义。结果1、血浆MDC水平检测和分析SLE初治组血浆MDC水平高于经治组、类风湿组和正常对照组。SLE经治组、类风湿组和正常对照组三组血浆MDC含量组间比较差异无统计学意义。15例LN病理类型分析,Ⅱ型和Ⅲ型狼疮性肾炎患者血浆MDC含量高于Ⅳ型。46例系统性红斑狼疮患者血浆MDC含量与对应的狼疮活动度评分SLEDAI分数呈正相关关系。2、小鼠24小时尿蛋白量和血肌酐的测定8周龄和12周龄时各组小鼠24小时尿蛋白量和血肌酐水平差异无统计学意义。16周龄时抗体干预组24小时尿蛋白量明显减少、血肌酐水平稳定,与MRL/lpr小鼠比较差异有统计学意义,而与BALB/c小鼠比较差异无统计学意义。3、小鼠肾组织RT-PCR分析结果对RT-PCR电泳成像结果进行灰度值测定,BALB/c小鼠肾脏组织中未检测到MDC、TARC和CCR4的表达,各组MRL/lpr小鼠肾组织可见MDC、TARC和CCR4的表达,抗体干预组MDC和CCR4mRNA表达低于MRL/lpr小鼠;MRL/lpr小鼠与抗体干预组小鼠肾组织TARCmRNA表达差异无统计学意义。4、小鼠肾组织Western Blot分析结果BALB/c小鼠肾脏组织中均未检测到MDC、TARC和CCR4的蛋白表达,抗体干预组小鼠肾组织MDC和CCR4蛋白表达水平低于MRL/lpr小鼠;MRL/lpr小鼠与抗体干预组小鼠肾组织TARC蛋白表达差异无统计学意义。5、小鼠肾组织常规病理学检查BALB/c小鼠肾小球血管袢薄而清晰,内皮细胞、系膜细胞和肾小管均正常;而MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,体积明显增大,肾小球囊腔狭窄,肾小管间质和肾小球内有炎症细胞浸润。抗体干预组肾小球及肾间质炎症细胞浸润较MRL/lpr小鼠明显减少。6、小鼠肾组织MDC和CD68免疫组化染色MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质浸润的炎症细胞胞质及间质基质均有MDC和CD68表达,以肾小管区域表达更为明显;抗体干预组小鼠肾组织MDC表达较MRL/lpr小鼠减弱;肾间质小管区域单核巨噬细胞浸润减少明显并与MDC面密度正相关。BALB/C小鼠肾组织MDC几乎无表达。结论初治SLE患者血浆MDC水平高于经治SLE患者、类风湿关节炎患者和正常对照组,SLE患者血浆MDC水平与24小时尿蛋白量、血肌酐和SLEDAI评分正相关。LN患者血浆中MDC含量与其病理类型存在明显的联系:Ⅱ型和Ⅲ型LN组高于Ⅳ型LN组。SLE疾病进程与血浆中MDC水平密切相关,提示MDC可能参与了SLE的发病和狼疮性肾炎病理损害的形成。16周龄MRL/lpr小鼠出现肾脏功能学和形态学改变等LN相关表现;MRL/lpr小鼠肾组织可见MDC明显表达。BALB/c小鼠肾组织MDC无明显表达。MDC不仅在SLE患者外周血中水平增高,在狼疮模型小鼠的肾组织中也明显增高,说明MDC可能参与介导了MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的病变过程。给予MDC抗体的狼疮小鼠肾脏功能和形态学上与无干预因素的狼疮小鼠相比较都有明显改善,抗体干预组MDC和CCR4mRNA和蛋白表达水平低于MRL/lpr小鼠。MDC在狼疮小鼠肾组织的高水平表达导致包括T细胞在内的单个核细胞在肾脏大量浸润可能是L N发生和进展的关键因素之一,MDC抗体通过抑制单个核细胞在狼疮小鼠肾组织的浸润,对肾脏损害有一定的缓解作用。
论文目录
相关论文文献
- [1].信号传导和转录激活因子3及其蛋白抑制剂在狼疮小鼠肾组织中的表达[J]. 南方医科大学学报 2012(06)
- [2].糖尿病小鼠肾组织中细胞焦亡发生的现象研究[J]. 贵州医科大学学报 2020(04)
- [3].双酚A对小鼠肾组织的毒性研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2009(09)
- [4].雷公藤多苷对狼疮小鼠肾组织高迁移率族蛋白-1及转化生长因子-β1表达的影响[J]. 中华临床免疫和变态反应杂志 2015(03)
- [5].抑瘤素M在糖尿病小鼠肾组织中的表达[J]. 中国现代医学杂志 2014(22)
- [6].分泌型卷曲相关蛋白-1在糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达及意义[J]. 中国老年学杂志 2018(10)
- [7].四君子汤干预小鼠肾组织增龄性改变的代谢组学研究[J]. 中医药学报 2017(04)
- [8].抗纤灵对5/6肾切除小鼠转化生长因子-β及其下游因子表达的影响[J]. 北京中医药 2016(08)
- [9].邻苯二甲酸二异壬酯致小鼠肾组织氧化损伤的研究[J]. 生态毒理学报 2015(03)
- [10].PTGES2在LPS所致急性肾损伤中对p62的抑制作用研究[J]. 中国病理生理杂志 2015(10)
- [11].p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究[J]. 东南大学学报(医学版) 2008(03)
- [12].芦丁对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾组织形态表现的影响[J]. 吉林大学学报(医学版) 2017(04)
- [13].MRL/lpr小鼠肾组织胸腺和活化调节趋化因子表达检测[J]. 中国医科大学学报 2010(03)
- [14].米酵菌酸对小鼠肾组织毒性作用的超微结构观察[J]. 中国医学创新 2010(24)
- [15].巨噬细胞衍生趋化因子在MRL/lpr小鼠肾组织中的异常表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2010(01)
- [16].骨形成蛋白4对单侧输尿管梗阻小鼠肾组织白细胞介素-1β表达及细胞凋亡的影响[J]. 儿科药学杂志 2017(08)
- [17].茯苓多糖对2型糖尿病小鼠肾组织抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表达影响[J]. 食品与生物技术学报 2016(01)
- [18].来氟米特对BXSB小鼠肾组织NF-κB的影响[J]. 广东医学 2009(12)
- [19].黄芪多糖对麻黄素损伤小鼠肾组织Bcl-2、转化生长因子-β1蛋白表达的影响[J]. 解剖学杂志 2017(04)
- [20].MRL/lpr小鼠肾组织CCR4受体表达检测[J]. 山东医药 2009(40)
- [21].虎杖有效成分对DN模型小鼠肾组织病理改变的影响[J]. 天津中医药大学学报 2020(04)
- [22].糖皮质激素对BXSB狼疮小鼠肾组织fractalkine/CX3CR1表达的影响[J]. 中国病理生理杂志 2009(07)
- [23].油椒木豆荚提取物对二甲基苯蒽诱导小鼠肾组织损伤的保护作用(英文)[J]. 中西医结合学报 2012(10)
- [24].糖原合成酶激酶-3α/β在糖尿病肾病小鼠肾组织中的分布和表达[J]. 华中科技大学学报(医学版) 2014(02)
- [25].苦参碱干预狼疮样小鼠肾组织表达MCP-1、核因子-κB及肾损伤的作用[J]. 中国药学杂志 2010(19)
- [26].γ-GCS及TGF-β1在MRL/1pr雌性小鼠肾组织表达研究[J]. 北方药学 2016(07)
- [27].Notch信号通路在糖尿病小鼠肾组织的表达及意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志 2014(05)
- [28].活性维生素D_3对输尿管结扎小鼠肾组织胶原Ⅳ蛋白表达的影响[J]. 同济大学学报(医学版) 2012(05)
- [29].帕立骨化醇抑制糖尿病肾病小鼠肾组织炎性反应研究[J]. 中国全科医学 2016(27)
- [30].系统性红斑狼疮小鼠肾组织γδT细胞TGF-β1表达研究[J]. 浙江中西医结合杂志 2012(02)
标签:系统性红斑狼疮论文; 狼疮性肾炎论文; 巨噬细胞衍生趋化因子论文; 反转录聚合酶链反应论文; 印迹法论文; 免疫组化论文;