用分子标记鉴定转Bt基因棉和检测纯度的技术研究

论文摘要

本研究以当前生产上广泛使用的 4 个棉花品种为试材,在 DNA 快速提取方法、PCR反应体系、RAPD 检测技术体系和 SSR 检测技术体系四个方面进行了研究,探讨了利用分子标记进行转 Bt 基因棉的品种鉴定和纯度检测技术,并与传统的卡那霉素法相比较,为转基因抗虫棉种子快速检测提供了依据。通过研究,得到如下结果: 1.卡那霉素法检测与 PCR 技术检测结果比较 用卡那霉素对转基因棉花中棉所41和国抗一号检测,检测结果分别为89%和86%。与用 PCR 技术检测结果进行比较,发现二者结果趋势一致,但卡那霉素的检测结果偏低。与 PCR 技术相比,卡那霉素法存在周期较长、比较费工、易受环境影响等缺点。用 PCR 技术进行品种鉴定,简便、快速、灵敏度高,需要的样品量少,检测不受时间、取样部位限制,且结果可靠。 2.建立了快速提取 DNA 的方法 本实验直接在常温下提取种子 DNA,获得了较好结果,这与前人的做法有很大区别。由于以转基因植物检测为目的,对 DNA 质量要求不高,因此去除了繁杂的纯化步骤,得到了理想效果。DNA 提取液仅仅加入了 SDS,没有 EDTA 和巯基乙醇等物质,提取液配制大大简化。具体程序如下:①将种子去皮砸碎,加入 10 倍（μl /mg）的预热（70℃）提取液（200mM Tris-HCl, PH=8.0,1.5% SDS）。②70℃水浴提取 10min,取出后立即加入等体积的酚:氯仿,8000rpm 离心 10 分钟。③取上清液 lμl,用作 PCR反应的模板。本实验的 DNA 提取方法,步骤简单、用时缩短、简化了提取液的配置。因此,大大提高了利用 PCR 技术检测转基因植株的实际应用,可在转基因棉花的品种鉴定和纯度检测中大量应用。 3. PCR 技术检测转基因抗虫棉 对用于转基因抗虫棉检测的 PCR 扩增程序进行了改进,使扩增时间缩短,特异性增强,建立了适用于 DNA 粗提液的相应 PCR 反应体系。具体如下:循环参数为 94℃预变性 2min,94℃变性 40s,适当温度退火 40s, 72℃延伸 50s, 30 个循环,72℃ 延伸 5min。反应体系:2.5μl 10×Buffer, 1.5μl Mg2+ （25mM）, lμl dNTP（2.5mM）, 0.2μl TaqE（5U）, 0.5μl Primer（20pmo1/μl）,lμl DNA 约 60ng, H20 17.8μl,共 25μl。用建立的 PCR 技术对转基因抗虫棉样品中棉所 41 和国抗一号进行了检测。检测结果两样品中转基因抗虫棉所占比例分别是 94%和 92%,证明所建立的检测体系是有效的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 引言
• 材料与方法
• 1 试验材料
• 2 仪器与试剂
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 3 试验方法
• 3.1 卡那霉素检测
• 3.2 DNA 制备方法的研究
• 3.3 转基因抗虫棉的PCR 测定
• 3.4 转基因抗虫棉纯度的RAPD 测定
• 3.5 转基因抗虫棉纯度的SSR 测定
• 结果与分析
• 1 卡那霉素检测结果
• 2 DNA 的提取
• 2.1 紫外检测
• 2.2 电泳检测
• 3 PCR 的检测
• 3.1 用未经改进的DNA 提取方法和扩增程序进行PCR 的结果
• 3.2 不同种子处理及提取液对扩增结果产生影响
• 3.3 提取时间的影响
• 3.4 PCR 反应程序的优化
• 4 RAPD 反应体系的建立
• 4.1 DNA 模板的用量
• 2+浓度'>4.2 Mg²⁺浓度
• 4.3 dNTPs 浓度与Taq 酶浓度
• 4.4 引物浓度
• 4.5 循环参数的影响
• 5 SSR 反应体系的建立
• 5.1 反应条件的优化
• 5.2 检测方法的比较选择
• 5.3 聚丙烯酰胺检测条件的优化
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介