论文摘要
随着生态环境的恶化,各种生物和非生物因素日益成为制约玉米生产的障碍。其中,干旱是限制玉米生产最主要的限制因子。通过品种选育改良玉米的耐旱性是减轻干旱危害最为经济有效的措施,但需要对耐旱性的遗传机制有一个较为深入的了解。玉米的耐旱性是由多基因控制的复杂性状,尽管已用多种分子生物学手段克隆了许多与之相关的功能基因,并对其在干旱胁迫条件下的表达特性等进行了多方面的研究,但仍然不能很好地解析玉米耐旱性的分子机理,为耐旱性遗传改良的分子育种提供技术支持。近年来的研究表明,一类非编码小分子RNA——microRNA （miRNA）,参与基因表达调节。研究其在干旱胁迫条件下的差异表达,可望从另一个方面揭示植物耐旱性的分子机理。有研究表明,植物中保守性很强的miR159和miR168与逆境胁迫调控有关。本实验根据已有的研究报道,以前期鉴定的玉米干旱敏感型自交系丹340、21ES和耐旱型自交系87-1、81565为材料,利用miRNA芯片杂交技术,检测miR159和miR168在聚乙二醇（PEG6000）模拟干旱胁迫条件下的差异表达。经锁核苷酸Northern （Locked-nucleic acid Norhtern, LNA-Northern）杂交验证后,用WMD3软件对miR159和miR168的靶基因进行生物信息学预测,并用数字基因表达谱（Digital Gene Expression Profiling, DGE）分析技术分析相同模拟干旱胁迫条件下这些靶基因在不同自交系间的表达差异,探索miR159和miR168在干旱胁迫条件下对其靶基因可能的调控模式。主要结果如下：1.在干旱胁迫条件下miR159家族的成员大多上调表达,但在耐旱性不同的自交系间及不同干旱胁迫时间段的表达差异情况不尽相同。由此推测,虽然miR159家族成员间的碱基序列大体相似,但对干旱胁迫的响应以及对靶基因的调控可能发挥不同的作用。2. miR168家族两个成员的表达水平在丹340、21ES和87-1自交系中均不同程度被抑制降低。但在强耐旱性自交系81565中,仅miR168b成员的表达水平发生了变化。暗示miR168a和miR168b这两个成员在干旱胁迫下可能扮演着不同的角色。3. LNA-Northern杂交验证miR168在相同干旱处理方式下的表达水平,发现Northern杂交结果和芯片杂交结果完全一致,证实了芯片杂交结果的可信性。4.使用在线靶基因预测软件WMD3,共预测到32个miR159的潜在靶基因,4个miR168的潜在靶基因。其中,一部分靶基因被多个miRNA家族内的成员共同调控,还有部分靶基因特异被某些（?）mRNA成员调控。这些靶基因都涉及各种最基本调控通路的上游。5.数字表达谱分析差异表达靶基因时发现：miR159的靶基因MYB55类似蛋白mRNA的表达水平特异在强耐旱自交系81565中下调。Rac GTP酶激活蛋白1mRNA的表达水平特异在干旱敏感型自交系中上调。RNA binding S1在每个自交系中都出现了表达量变化,但在81565中的表达趋势与其他三个自交系相反；miR168的靶基因AGO1在除丹340的其他三个自交系中上调表达,在胁迫的后期阶段,下调的miR168强烈的上调AtIDD2类似蛋白mRNA的表达水平,其表达量的差异与未处理材料相比较达到了1379.57倍。6.将差异表达的靶基因结合起来总体分析miR159和miR168潜在的调控机制,推测保守的miR159和miR168家族可能是干旱应答途径上游的调控因子。