GPV感染鹅免疫组织中病毒的检测及免疫抑制的研究

论文摘要

小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称鹅细小病毒病（Goose parvovirus infection）,是由鹅细小病毒引起的雏鹅急性败血性传染病。1956年我国方定一在扬州首次发现小鹅瘟病毒（GP Virus, GPV）,1971年Schettler确定这种病是由细小病毒引起的。1978年WPA又建议把这种病称为鹅细小病毒感染。病原定名为鹅细小病毒（Goose parvovirus, GPV）。GPV侵害420日龄雏鹅及雏番鸭（Muscovy Ducklings）,传染性强、传播迅速、死亡率达90%,GPV感染雏鹅后,各组织器官均呈现广泛的病理损伤,病变较为严重的为小肠,其次为免疫系统,其他各组织器官也出现相应的病变。GPV感染给养鹅业带来极大的经济损失。国内外学者对小鹅瘟开展的大量了研究并取得了一定的进展,但是在发病机制方面的研究还甚少。本研究应用分子生物学技术克隆小鹅瘟病毒VP3基因,之后利用基因工程技术在原核表达系统中表达了VP3蛋白并制备出了多克隆抗体;应用PCR方法和免疫组化方法检测了GPV感染雏鹅脾脏、法氏囊、胸腺中的病毒分布;同时也检测了脾脏、法氏囊、胸腺中IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γmRNA和PPAR-γmRNA表达量的变化,结果表明:1根据GenBank发表的GPV B株全基因序列,应用Oligo 6.0与Primer Premier 5.0软件设计一对引物,采用PCR技术克隆GPV VP3基因,并将VP3基因插入到原核表达质粒pGEX-6p-1的BamH I、Xho I多克隆位点之间,将重组原核表达质粒pGEX-6p-VP3转化到Rosetta感受态细胞中,获得了表达VP3基因的阳性亚克隆重组子,经IPTG诱导表达,VP3基因在原核表达菌Rosetta中获得高效表达,表达产物约83 KD的GST-VP3融合蛋白。2利用重组蛋白免疫8周龄Balb/c鼠,成功制备出抗GPV的多克隆抗体并用间接ELISA方法检测抗体效价,效价达到1:25 600,采用Western-blot检测出多克隆抗体对于融合蛋白具有特异性。3在小鹅瘟病毒感染后2 d、4 d、6 d、8 d,通过PCR和免疫组化法在雏鹅脾脏、法氏囊、胸腺均能检测到病毒。各组织中病毒的分布规律有所差别,随着时间的延长病毒的含量也有所变化。在感染后4 d6 d病毒载量达高峰。4 GPV感染后能引起免疫组织结构的损伤,并不同程度的影响脾脏、法氏囊和胸腺内IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γmRNA的表达水平。在病毒感染的前期,脾脏、法氏囊和胸腺IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γmRNA表达量有升高的趋势,而到第8 d免疫组织中上述基因mRNA表达量均骤然降低,且均低于对照组,表明GPV感染后引起了雏鹅的免疫抑制。5通过对胸腺、脾脏、法氏囊、PPAR-γ基因mRNA表达的检测,首次证实雏鹅PPAR-γ基因表达于胸腺、脾脏与法氏囊。同时证明小鹅瘟病毒感染可以影响PPAR-γ基因在雏鹅胸腺、脾脏、法氏囊、内的表达,而且PPAR-γ基因对在病毒感染的不同时期、不同的组织会呈现出不同的表达,提示PPAR-γ基因参与了雏鹅免疫功能的调节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 小鹅瘟的流行病学和临床症状
• 1.1.1 流行病学
• 1.1.2 临床症状
• 1.1.3 剖检变化
• 1.1.4 组织学变化
• 1.2 小鹅瘟病毒概述
• 1.2.1 GPV 的形态和理化学特性
• 1.2.2 病毒培养特性
• 1.2.3 基因组结构
• 1.3 病毒感染对免疫系统的影响及抗病毒免疫
• 1.3.1 病毒感染对免疫系统的影响
• 1.3.2 抗病毒免疫
• 1.4 过氧化物酶体增生物激活受体与免疫
• 1.5 实验的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要材料与试剂
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 主要的菌株与载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验动物及分组
• 2.4 引物的设计与合成
• 2.5 GPV VP3 基因的克隆、原核表达、多克隆抗体制备
• 2.5.1 GPV VP3 基因序列的克隆与鉴定
• 2.5.2 GPV VP3 重组表达载体的构建与鉴定
• 2.5.3 GPV VP3 基因在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定
• 2.5.4 抗GPV VP3 的多克隆抗体的制备和鉴定
• 2.6 人工感染GPV 后雏鹅的临床症状及病理变化的观察
• 2.7 免疫组织中病毒的检测
• 2.7.1 PCR 方法检测免疫组织中GPV
• 2.7.2 免疫组化方法检测免疫组织中GPV
• 2.8 人工感染GPV 后IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γmRNA 及PPAR-γmRNA 表达的检测
• 2.8.1 总RNA 的提取
• 2.8.2 反转录反应
• 2.8.3 实时定量PCR 扩增
• 2.8.4 融解曲线分析
• 2.8.5 △△Ct 法分析基因表达的相对差异
• 2.9 试验数据的分析与统计
• 3 结果与分析
• 3.1 GPV VP3 基因的克隆、原核表达、多克隆抗体的制备
• 3.1.1 病毒核苷酸的提取和模版的检测
• 3.1.2 VP3 基因的PCR 扩增结果
• 3.1.3 VP3 基因序列的测序结果
• 3.1.4 重组表达载体的构建与鉴定
• 3.1.5 融合蛋白的表达、鉴定与纯化
• 3.1.6 多克隆抗体的制备和鉴定结果
• 3.2 人工感染GPV 后雏鹅的临床症状及病理变化
• 3.3 雏鹅免疫组织中病毒的检测结果
• 3.4 鹅IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γ和PPAR-γ基因mRNA 表达的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 GPV VP3 蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
• 4.2 GPV 感染对雏鹅免疫组织结构的影响
• 4.3 GPV 在感染雏鹅免疫组织中的分布规律
• 4.4 GPV 感染对胸腺、脾脏、法氏囊、细胞因子表达的影响
• 4.4.1 GPV 感染对胸腺、脾脏、法氏囊、IL-8 mRNA 表达量的的影响
• 4.4.2 GPV 感染对胸腺、脾脏、法氏囊、IL-18 mRNA 表达量的的影响
• 4.4.3 GPV 感染对胸腺、脾脏、法氏囊、干扰素mRNA 表达量的影响
• 4.5 GPV 感染对胸腺、脾脏、法氏囊、PPAR-γmRNA 表达量的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A：英文缩写词表
• 附录B：试验结果附图
• 攻读硕士期间发表的学术论文