木聚糖酶的克隆表达及初步应用的研究

论文摘要

木聚糖酶（Xylanase）属于蛋白酶，具有酶类最突出的特异催化活性，在木聚糖酶的催化作用下，木聚糖能降解为分子量更低的低木聚糖和木糖，但木聚糖如完全降解则需要多种酶的协同作用。本实验重点从两个方面对该酶进行了初步研究。第一，从分子生物学方面研究了木聚糖酶基因分别在原核和真核生物中的分泌及表达情况。首先，分别构建原核表达载体pET28a-xyn和真核表达载体pPIC9K，并将这两种表达载体分别转化到宿主菌E. coli BL21（DE3）和毕赤酵母（Pichia pastoris）中，分别经IPTG和甲醇诱导表达，最后对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测，以确定基因是否表达。结果显示，木聚糖酶基因在原核表达体系和真核表达体系中都能够表达。但原核表达体系表达的木聚糖酶没有活性，而在真核表达系统中表达的木聚糖酶具有天然的酶活性，经鉴定，真核表达系统表达的木聚糖酶分子量却比预测的值要高。第二，从黑曲霉发酵产物中得到木聚糖酶粗发酵液，过滤提取并纯化，鉴定酶活，对选择的马尾松纸浆预处理。结果表明，经纯化处理过的木聚糖酶可提高纸浆白度等其各方面的物理性能，该酶对纸浆预处理的最佳工艺条件为：pH4.55.0、温度4050℃、处理时间12h、酶添加量3040IU/g。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 木聚糖酶概述
• 1.1 概念
• 1.2 结构特点
• 1.3 酶学性质
• 1.3.1 温度的影响
• 1.3.2 pH 的影响
• 1.4 木聚糖酶的发酵生产
• 1.4.1 菌种选择
• 1.4.2 诱导培养基的选择
• 1.4.3 分离纯化
• 1.5 木聚糖酶基因的诱导和表达
• 1.5.1 木聚糖酶酶的诱导和表达
• 1.5.2 原核微生物表达
• 1.5.3 真核微生物表达
• 1.6 木聚糖酶的应用现状
• 1.6.1 造纸工业
• 1.6.2 动物饲料工业
• 1.6.3 酒精发酵工业
• 第二章 木聚糖酶基因在两种不同表达体系中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基及其有关溶液的配制
• 1.2.1 酵母表达贮存液配制
• 1.2.2 常用培养基的制备
• 1.3 试剂和仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 原核表达载体的构建
• 1.4.2 真核表达载体的构建
• 1.4.3 转化
• 1.4.4 转化子的筛选与鉴定
• 1.4.5 工程菌的培养和目的蛋白酶的诱导
• 1.4.6 表达产物的活性检测及 SDS-PAGE 分析
• 2 结果和讨论
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.1.1 表达载体菌液 PCR
• 2.1.2 表达载体酶切验证
• 2.1.3 重组基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2 酵母表达载体的构建
• 2.3 酵母的转化和鉴定
• 2.3.1 酵母的转化
• 2.3.2 酵母转化子的 PCR 鉴定
• 2.4 木聚糖酶酶活测定和 SDS-PAGE
• 2.4.1 木聚糖酶的酶活测定
• 2.5 讨论
• 2.5.1 酵母 GS115 表达的目的蛋白酶活性（DNS 法）
• 2.5.2 目的蛋白酶分泌量和表观分子量
• 2.5.3 原因分析
• 3 小结
• 第三章 木聚糖酶的纯化及其纸浆预漂白中的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验菌株
• 1.1.2 纸浆
• 1.1.3 仪器与试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 各种培养基配制
• 1.2.2 DNS 法测定酶活
• 1.2.3 发酵液中蛋白酶含量的测定
• 1.2.4 标准曲线的绘制
• 1.2.5 木聚糖酶的分离与纯化
• 1.2.6 SDS-PAGE 及酶谱分析
• 1.2.7 木聚糖酶预漂白处理纸浆
• 1.2.8 碱抽提（E）处理
• 1.2.9 结合过氧化氢（H2O2）的漂白
• 1.2.10 纸张样品抄取
• 1.2.11 纸张物理指测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 木聚糖酶的制备
• 2.2 木聚糖酶的酶活测定
• 2.3 木聚糖酶的分离纯化
• 2.3.1 木聚糖酶的 SDS-PAGE 和酶谱分析
• 2.4 纸张各项物理指标的检测
• 2.4.1 不同 pH 对过氧化氢漂白后纸张各项物理指标的影响
• 2.4.2 不同温度对过氧化氢漂后纸张各项物理指标的影响
• 2.4.3 不同时间对过氧化氢漂白后纸张各项物理指标的影响
• 2.4.4 不同酶添加量对过氧化氢漂后纸张各项物理指标的影响
• 2.4.5 不同预漂白处理条件对过氧化氢漂后纸张单一指标的影响比较
• 2.5 讨论
• 3 小结
• 参考文献
• 致谢