鞘内注射NMDA受体激动剂NMDA上调大鼠脊髓后角环氧化酶-2的表达

论文摘要

目的:前列腺素（prostaglandins, PGs）,特别是前列腺素E2和前列环素是重要的炎症、疼痛和发热介质。环氧化酶（cyclooxyganese, COX）是合成PGs的限速酶。在伤害性刺激传入引起痛及痛过敏时,COX-2和PGs发挥重要的作用。例如,预先口服或鞘内给予COX-2抑制剂均可以剂量依赖的方式产生抗伤害性感受作用。应用免疫组织化学、Western blot等方法的研究显示,在大鼠外周炎性痛及痛过敏模型中,脊髓中COX-2蛋白表达增加,进一步证实了COX-2及其催化产生的PGs在脊髓伤害性信息传递中的重要作用。但是,在这一过程中脊髓COX-2表达增多的机制尚不完全清楚。大量证据表明,兴奋性氨基酸（excitatory amino acids, EAAs）及其受体,特别是N-methyl-D-aspartate （NMDA）受体在脊髓伤害性信息的传递中发挥重要作用。同时,有资料显示,伤害性传入引起的痛及痛过敏过程中脊髓后角COX-2表达的增加可能与NMDA受体的激活有关。例如,在白陶土和角叉菜胶以及福尔马林等诱发的痛及痛过敏过程中,大鼠脊髓谷氨酸和PGE2的释放都增加;NMDA受体拮抗剂和选择性COX-2抑制剂均能显著降低福尔马林实验的疼痛行为;鞘内给予NMDA引起的伤害性感受,可剂量依赖性的被鞘内或全身给予选择性COX-2抑制剂所抑制。我室最近应用免疫组化技术研究发现,给大鼠足底注射福尔马林或鞘内注射NMDA受体激动剂NMDA诱导大鼠伤害性感受的同时,使脊髓后角COX-2表达增加。预先鞘内注射NMDA受体非竞争性抑制剂MK-801可抑制COX-2表达的上调。初步提示NMDA受体的活动是介导炎性痛及痛过敏过程中脊髓后角COX-2表达增加的原因之一。本课题则在此基础上,采用Western blot和RT-PCR技术,进一步观察鞘内注射NMDA受体特异性激动剂NMDA对COX-2蛋白和mRNA表达的影响,为阐明NMDA受体激活在伤害性信息传入引起脊髓后角COX-2表达增多中的作用提供进一步的实验依据。方法:雄性Spague-Dawley大鼠110只,体重280±20克,随机分为以下各组:sham组:鞘内注射生理盐水10μl。于相应时间点取材观察。NMDA I组:鞘内注射NMDA溶液10μl。根据NMDA的注射剂量,进一步分为0.1 nmol, 1 nmol, 10 nmol三个亚组。各组动物于鞘内注射后4小时取材,观察NMDA上调脊髓后角COX-2表达的剂量依赖性。MK-801+NMDA组:首先鞘内注射MK-801生理盐水溶液10μl （50 nmol）,15 min后鞘内注射NMDA溶液10μl （10 nmol）,注射NMDA后4小时取材,观察MK-801对NMDA引起的脊髓后角COX-2表达上调的影响。NMDA II组:鞘内注射NMDA 10 nmol,于注射后1 h、2 h、4 h、24 h、36 h、（仅限于Western blot分析）、和3 d（仅限于Western blot分析）,测定热甩尾潜伏期、热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值后取材,观察鞘内注射NMDA后脊髓后角COX-2表达的时相特点及其与痛觉过敏的时间对应关系。上述各组中,每个亚组10只动物,其中5只用于Western blot检测脊髓后角COX-2蛋白的表达,5只用于RT-PCR检测脊髓后角COX-2 mRNA表达的变化。数据用均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验,以（P<0.05）作为判断差异显著性的标准。结果:1痛行为反应大鼠鞘内注射NMDA后动物出现了特征性的伤害性行为反应,包括紧张性的抓、咬、舔、扭体和吱叫等。1.1热甩尾和热缩足潜伏期与sham组相比,NMDA 1 h组、2 h组、4 h组、以及24 h组的热甩尾潜伏期明显缩短（P<0.05）,表明鞘内注射NMDA后早期即可出现热痛觉过敏,并且这种痛觉过敏可持续较长时间。NMDA 36 h和3 d组的热甩尾潜伏期已基本恢复到正常水平,表明鞘内NMDA引起的热痛觉过敏已恢复。热缩足潜伏期的变化特点与热甩尾相类似。1.2机械缩足反射阈值与sham组相比,大鼠鞘内注射NMDA后1 h机械缩足反射阈值即已明显降低,这一降低可持续至鞘内注射NMDA后36 h,表明鞘内注射NMDA后早期即可出现机械痛觉过敏,并且这种痛觉过敏可持续较长时间。NMDA 3 d组与sham相比无显著性差异,表明鞘内注射NMDA引起的机械痛敏已恢复。2鞘内注射NMDA上调脊髓后角COX-2的表达随大鼠鞘内给予NMDA剂量的增加（0.1 nmol, 1 nmol和10 nmol）,脊髓后角COX-2蛋白和mRNA的表达逐渐升高,呈明显的剂量依赖性（P<0.05）。预先鞘内注射NMDA受体阻断剂MK-801可显著抑制上述NMDA引起的COX-2表达的上调（P<0.05）。3鞘内注射NMDA引起的脊髓后角COX-2表达上调的时间特征与其所引起的痛行为时间特征相一致鞘内注射NMDA后2小时,脊髓后角COX-2蛋白的表达与对照组相比开始增加,4 h达到高峰,随后逐渐下调,至3 d时基本恢复到sham水平（P<0.05）。鞘内注射NMDA后,脊髓后角COX-2 mRNA的表达呈现与COX-2蛋白相类似的结果,但COX-2 mRNA表达上调的开始时间早于COX-2蛋白,提前至NMDA注射后1 h,同时上调的mRNA表达恢复至sham水平的时间也提前至24 h（P<0.05）。上述COX-2蛋白和mRNA上调的时间过程与鞘内NMDA后痛行为表现的时间特征相吻合。结论:1大鼠鞘内注射NMDA受体特异性激动剂NMDA可剂量依赖性地上调脊髓后角COX-2的表达2这种上调可被NMDA受体非竞争性抑制剂MK-801所抑制,并且与鞘内NMDA引起的痛行为反应时间过程特点相吻合。3这些结果提示,在伤害性传入引起的痛及痛过敏过程中,脊髓内NMDA受体的活动是引起脊髓后角COX-2表达上调的原因之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 鞘内注射NMDA 受体激动剂NMDA 上调大鼠脊髓后角环氧化酶-2 的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 兴奋性氨基酸及其受体与环氧化酶在疾病中的作用
• 致谢
• 个人简历