拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆与体外表达

论文摘要

为了获得拟南芥抗灰葡萄孢相关基因，在拟南芥Col-0生态型可以抵抗灰葡萄孢侵染的基础上，将51，600个此生态型的T-DNA插入突变体接种该病菌以后，选定单拷贝的感病突变体△bosA（Botrytis susceptible mutant）为进一步的试验材料，提取其DNA，利用TAIL-PCR技术获得了插入片段的侧翼序列，在http://www.arabidopsis.org/和www.ncbi.nih.gov网站上，对得到的侧翼序列运用BLAST软件分析，发现T-DNA插入位点在AT1g01800基因（命名为bosA）的第4个外显子处，AT1G01800属SDR（short-chain dehydrogenase/reductase）家族蛋白，将该基因进行原核表达后，提取活性蛋白发现对灰葡萄孢没有直接的抑制作用。经过生物和非生物胁迫发现该基因在诱导抗病中起作用。试验从51，600个拟南芥T-DNA插入突变体中筛选到12个灰葡萄孢的感病突变体。通过接种后表型鉴定和在细胞水平上进行组织病理学染色观察发现，感病突变体在接种第1d就有少许的死细胞出现，且随着接种时间延长细胞坏死速度加快，接种第5d后叶片上出现肉眼可见的水渍状病斑，第8d，整个叶片干枯死亡，在显微镜下可以看到死亡的叶片细胞内充满了灰葡萄孢的菌丝。而野生型Col-0植株的叶片上只出现了过敏性坏死斑。将得到的12个感病突变体进行了Southern杂交验证了T-DNA插入片段的拷贝数，选定了T-DNA插入为单拷贝的134号突变体（命名为△bosA）为进一步研究对象。TAIL-PCR技术是扩增已知序列的侧翼未知序列的一种方法，本试验经过对TAIL-PCR的多个影响因素进行了优化，并利用优化的TAIL-PCR条件扩增插入片段的左侧侧翼序列，经BLAST软件分析获知插入位点为bosA基因的956与957位碱基之间。初步确定该基因与抗灰葡萄孢相关。bosA基因编码一个分子量为31.66KD且pI为5.03的蛋白，属于短链的脱氢酶／还原酶家族蛋白（short-chain dehydrogenase／reductase（SDR）），具有氧化还原酶活性。将体外表达的BOSA活性蛋白与灰葡萄孢共培养，发现蛋白对病菌没有直接的抑制作用；△bosA接种芸苔链格孢以后，表现出与野生型不同的症状；接种细菌Pst.DC3000后，△bosA表现出比野生型的感病性增强。因此可以确定bosA基因对灰葡萄孢的抗性不是属于基因对基因的抗性模式，而是属于诱导抗病性的模式。对该突变体进行了一系列的非生物胁迫，发现bosA基因在抵抗某些非生物胁迫中也起着重要作用。经过DAB染色法研究发现，在接种灰葡萄孢以后，突变体的H2O2的含量明显的高于野生型，且在第2d达到最大量，由此可以得知，该突变体对灰葡萄孢增强感病性与ROIs（Reactive Oxygen Intermediates）相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试植物
• 2.1.2 供试菌株
• 2.1.3 供试培养基
• 2.1.4 拟南芥营养液配方
• 2.1.5 试剂
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株的培养与繁殖
• 2.2.2 拟南芥的种植
• 2.2.3 灰葡萄孢病菌孢悬液的制备
• 2.2.4 接种
• 2.2.5 感病植株的筛选及Trypan Blue染色
• 2.2.6 Sourthern杂交验证插入拷贝数
• 2.2.7 T-DNA插入位点侧翼序列的获得
• 2.2.8 候选基因的初步定位（DNA片段的回收、克隆和测序）
• 2.2.9 抗病基因的原核表达
• 2.2.10 目的蛋白的表达
• 2.2.11 生物胁迫
• 2.2.12 非生物胁迫
• 2.2.13 过氧化氢含量的测定（DAB染色）
• 3 结果与分析
• 3.1 感病突变体的筛选
• 3.2 Southern杂交验证拷贝数
• 3.2.1 DNA的提取
• 3.2.2 杂交探针的制备
• 3.2.3 Southern杂交验证得到其T-DNA插入拷贝数
• 3.3 T-DNA插入位点侧翼序列的获得
• 3.3.1 TAIL-PCR反应条件
• 3.3.2 回收片段的阳性克隆筛选
• 3.4 抗病相关基因的确定
• 3.5 抗病基因的原核表达
• 3.5.1 bosA基因引物的设计
• 3.5.2 bosA基因的PCR扩增
• 3.5.3 pMD-bosA和pET-21b（+）双酶切的结果
• 3.5.4 重组质粒的PCR检测
• 3.5.5 目的蛋白的表达
• 3.5.6 bosA基因对灰葡萄孢的作用
• 3.6 对ΔbosA的非生物胁迫研究
• 3.6.1 盐胁迫
• 3.6.2 寒冷胁迫
• 3.6.3 干旱胁迫
• 3.7 对ΔbosA的生物胁迫研究
• 3.7.1 对其它病原真菌侵染的反应
• 3.7.2 对病原细菌的侵染反应
• 2O₂含量分析'>3.8 灰葡萄孢侵染后拟南芥植株的内源H₂O₂含量分析
• 4 讨论
• 4.1 TAIL-PCR的影响因素
• 4.2 bosA与抗灰葡萄孢之间的关系
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢
• 附录