bHLH同源基因的表达对菊花花色的影响

论文摘要

菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）是中国传统名花,具有丰富的花色变异,但是唯独缺少蓝色。传统育种手法有一定局限性,分子育种技术为蓝色菊花育种开辟了新思路。导入外源花青素苷合成途径中的调节基因可以作为调控花青素苷积累的有效手段。但是迄今为止还未见在菊花中导入调节基因并获得花色改变的株系的报道。bHLH是花青素苷合成途径上重要的转录因子。研究外源bHLH基因导入对菊花花色的影响对开展菊花花色改良的分子育种具有实际意义,对于开展花色调控机理的理论研究也具有参考价值。本研究通过分析菊花内源花青素苷相关基因bHLH的表达模式,探讨bHLh基因对菊花花青素苷合成的作用；并导入外源bHLH基因,对比基因表达与花色表现之间的关系,研究其调控菊花花色形成的分子机理,以期从转录因子的角度为菊花花色改良奠定分子基础。本研究主要取得如下成果：（1）利用RT-PCR的方法从中国传统单头切花菊‘日切桃红’Hl级别中分离得到了菊花花青素苷合成途径相关基因bHLH的cDNA片段。经测序比对发现,所获得的片段与花青素苷合成途径相关的bHLH基因有着较高的相似性。半定量RT-PCR结果显示,该基因仅在菊花的花器官中检测到转录本。（2）采用半定量RT-PCR的方法分析CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS这6个结构基因和MYB、WD40、bHLH这3个调节基因在‘日切桃红’粉色花及其白花突变体的舌状花不同发育阶段的表达模式。结果表明：在白色花突变体的花序舌状花中关键结构基因和调节基因的表达强度和野生型比较都不同程度地降低了。突变体中bHLH基因表达不正常,几乎检测不到转录本。（3）通过农杆菌介导法将编码玉米bHLH类转录因子的Lc基因导入‘日切桃红’中。试验共侵染2883个外植体,经卡那霉素筛选获得25株抗性苗,最后PCR检测获得15个阳性株系,转化率为0.52%。RT-PCR结果显示有2个株系检测到了Lc的转录本,且关键结构基因的表达上调。相比较于野生型,转基因株系花色加深；色差仪检测结果显示,花色表型出现红移和蓝移；对舌状花中的色素含量和成分进行HPLC测定的结果显示,转基因株系花青素苷含量显著增加,但没有新的色素生成。上述研究结果表明：花青素苷合成途径上的调节基因bHLH在菊花花青素苷合成过程中具有重要作用,异源表达bHLH同源基因Lc可以使花青素苷含量增加。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词英汉对照表
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 花色形成机理研究进展
• 1.1.1 花色形成的化学机制
• 1.1.1.1 影响花色形成的化学物质
• 1.1.1.2 花青素苷代谢途径
• 1.1.2 花青素营合成途径的遗传调控
• 1.1.2.1 花青素营合成途径中的转录因子
• 1.1.2.2 转录因子对花青素苷合成的调控
• 1.1.2.3 转录因子对环境调控的响应
• 1.1.3 bHLH基因家族在花青素苷合成中的作用
• 1.1.3.1 花青素营合成途径相关基因bHLH的调控机制
• 1.1.3.2 Lc基因研究进展
• 1.1.4 花色改良的分子育种研究进展
• 1.1.4.1 反义抑制和共抑制
• 1.1.4.2 导入外源基因
• 1.2 菊花花色研究进展
• 1.2.1 菊花花色形成的化学机制
• 1.2.2 菊花花青素苷合成途径的遗传调控机制
• 1.2.3 菊花花色改良的分子育种概况
• 1.3 本研究的设计思想
• 1.3.1 本研究目的和意义
• 1.3.2 本研究主要内容
• 1.4 本研究的技术路线
• 2 菊花bHLH同源基因的分离及表达分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 舌状花发育的分级标准
• 2.1.3 花瓣总RNA的提取和cDNA的合成
• 2.1.4 bHLH同源基因片段的分离
• 2.1.4.1 RT-PCR反应体系及反应程序
• 2.1.4.2 菊花bHLH同源基因片段的分离
• 2.1.4.3 目的基因片段的连接转化和测序
• 2.1.5 bHLH同源基因的时空表达分析
• 2.1.5.1 引物设计
• 2.1.5.2 RT-PCR反应程序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菊花bHLH同源基因的序列结构
• 2.2.2 菊花bHLH同源基因的时空表达模式
• 2.3 讨论
• 2.3.1 菊花bHLH同源基因序列特征
• 2.3.2 菊花bHLH同源基因功能推测
• 2.4 小结
• 3 菊花突变体中花青素苷合成途径关键基因表达模式分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 花瓣总RNA的提取和cDNA的合成
• 3.1.3 菊花花青素苷合成途径关键基因的RT-PCR分析
• 3.1.3.1 引物设计
• 3.1.3.2 PCR体系和PCR程序
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 粉色花和突变体中关键结构基因的表达差异
• 3.2.2 粉色花和突变体中调节基因的表达差异
• 3.3 讨论
• 3.3.1 粉色花和突变体中花青素苷合成相关丛因的表达差异分析
• 3.3.2 白花突变体花色缺失的分子机理推测
• 3.4 小结
• 4 玉米Lc基因导入对菊花花色的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 质粒和农杆菌菌株
• 4.1.3 农杆菌介导Lc基因转化菊花
• 4.1.3.1 材料准备
• 4.1.3.2 菌液制备
• 4.1.3.3 农杆菌转化菊花
• 4.1.4 转化苗基因组的PCR扩增
• 4.1.4.1 植物基因组DNA的提取
• 4.1.4.2 基因组PCR扩增
• 4.1.5 转基因株系的RT-PCR分析
• 4.1.6 转化苗的花色表型测定
• 4.1.7 转化苗舌状花花青素苷的HPLC分析
• 4.1.7.1 花青素苷成分提取
• 4.1.7.2 花青素苷成分的HPLC分离
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 转Lc基因株系的获得
• 4.2.2 抗性苗的PCR检测
• 4.2.3 转化苗的RT-PCR分析
• 4.2.4 Lc转基因株系的表型测定
• 4.2.5 Lc转基因株系舌状花花青素苷的HPLC分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 Lc基因的转化效率
• 4.3.2 Lc基因在菊花中异源表达对菊花花色的影响
• 4.4 小结
• 5 结论
• 参考文献
• 个人简介
• 获得成果目录清单
• 导师简介
• 致谢