miRNA干扰HPA表达对胆囊癌细胞生物学行为影响的体外研究

论文摘要

胆囊癌恶性程度高，预后极差，手术切除率低，主要原因是出现症状时多已属晚期，已发生侵润和转移。乙酰肝素酶（heparanase, HPA）是一种内源性β-D-葡萄糖醛酸酶，是哺乳动物细胞内唯一具有降解位于细胞表面、细胞外基质及基底膜的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）的多糖侧链-硫酸乙酰肝素链（HS）功能的酶。能特异性的水解HS的结构，削弱细胞间质的屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁，与肿瘤的侵袭、转移密切相关。近年来研究发现越来越多的癌症组织中有HPA的表达上调，其表达与肿瘤的局部侵犯和远处转移呈正相关，与术后的生存率呈负相关，提示HPA作为预后标志物的可能。若能干扰HPA在肿瘤中的表达，有望抑制肿瘤的侵袭与转移。本研究采用miRNA干扰抑制人胆囊癌GBC-SD细胞中HPA靶基因的表达，采用脂质体介导的转染方法，将HPA导入体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞，研究miRNA干扰HPA的表达对靶细胞的影响，以揭示HPA在人胆囊癌细胞侵袭、转移机制中的作用，探讨HPA作为预防和治疗胆囊癌侵袭、转移的新靶点可能，而RNA干扰技术可能会成为肿瘤治疗的一个新途径，为进一步开展临床应用研究奠定基础。第一部分HPA在人胆囊癌GBC-SD细胞中表达的研究研究目的：检测人胆囊癌GBC-SD细胞中HPA mRNA、HPA蛋白表达情况。研究方法：取对数生长期的人胆囊癌GBC-SD细胞，通过RT-PCR法、Western blot和细胞免疫组化法检测GBC-SD细胞中HPA mRNA、HPA蛋白表达水平。研究结果： RT-PCR检测显示HPA mRNA片段大小为585bp，β-actin为218bp，与理论值相符，HPA mRNA表达强度为1.00±0.04。Western blot显示HPA蛋白分子量大小为65KDa，β-actin为43KDa，与理论值相符。HPA蛋白表达强度为研究结论：HPA在人胆囊癌GBC-SD细胞中是高表达的。第二部分miRNA干扰HPA对GBC-SD细胞HPA mRNA表达及HPA蛋白表达的影响研究目的:构建人HPA基因的特异性干扰表达载体miRNA，筛选有效干扰质粒。研究方法:根据Gene ID：10855提供的基因序列，利用invitrogen公司的在线RNAi设计工具，设计针对HPA基因的不同位点的4个特异性miRNA干扰序列；将选择的序列和相应的基因组数据库进行BLAST序列比对，确信所选择的序列与其他的基因不具有同源性；以鼠miR-155为骨架构建4个针对HPA基因的特异性miRNA载体，并进行DNA测序验证。用Lipofectamine2000介导分别将质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR–HPA-1、-2、-3、-4转染入人胆囊癌GBC-SD细胞株，实验另设阴性对照组（转染pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-neg）及空白对照组（未转染组），瞬转48小时后通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率，分别采用RT-PCR和Western blot蛋白印迹法检测HPA mRNA及蛋白表达变化情况，筛选出干扰效率最强的一个质粒载体。研究结果：DNA测序分析证实，pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR–HPA-1（HPA1）、pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-HPA-2（HPA2）、pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR–HPA-3（HPA3）、pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-HPA-4（HPA4）中的插入片段序列均与设计的miRNA oligo序列一致，4个针对HPA基因的miRNA载体均构建成功。RT-PCR检测细胞转染48h后空白对照组、阴性对照组、HPA1、HPA2、HPA3、HPA4组，HPA mRNA相对表达量分别为0.96±0.08、0.90±0.07、0.30±0.04、0.24±0.05、1.06±0.06、0.36±0.09。Western blot检测细胞转染48h后空白对照组、阴性对照组、HPA1、HPA2、HPA3、HPA4组，HPA蛋白相对表达量分别为0.79±0.03，0.76±0.02，0.39±0.01，0.34±0.02，0.80±0.03，0.42±0.01。可见质粒HPA2组沉默人胆囊癌GBC-SD细胞HPA mRNA和蛋白表达的效果最好。选取HPA2组质粒作为沉默效果最佳的质粒载体，进行后续实验。研究结论：认为pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR载体构建有效，HPA2组质粒作为沉默效果最佳的质粒载体，进行后续实验。第三部分miRNA干扰HPA表达对胆囊癌细胞生物学行为的影响研究目的：探讨miRNA干扰沉默HPA基因表达对人胆囊癌GBC-SD细胞生物学行为的影响。研究方法：采用激光共聚焦显微镜和Giemsa染色法观察转染前后细胞形态有无变化，噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖变化，流式细胞仪检测GBC-SD细胞干扰后细胞周期与凋亡的改变，再通过划痕损伤实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验检测干扰沉默HPA表达后对人胆囊癌GBC-SD细胞侵袭和迁移能力的影响。研究结果：激光共聚焦显微镜和Giemsa染色法观察转染前后细胞形态无改变，MTT法检测miRNA干扰沉默人胆囊癌GBC-SD细胞HPA基因表达对细胞增殖无影响，流式细胞仪检测GBC-SD细胞干扰后细胞周期无明显变化，但可增加细胞早期凋亡，与阴性对照组和空白对照组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。HPA2组中穿过Transwell小室基质的胆囊癌GBC-SD细胞数明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。胆囊癌GBC-SD细胞的迁移距离在0h、12h、24h，HPA2组明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。研究结论：RNAi沉默GBC-SD细胞中HPA基因的表达，能有效抑制胆囊癌细胞的侵袭、迁移能力，并可影响细胞的凋亡，但对该细胞的增殖、周期没有影响。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 HPA在人胆囊癌GBC-SD细胞中表达的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分miRNA干扰HPA对GBC-SD细胞HPA mRNA表达及HPA蛋白表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 miRNA干扰HPA表达对胆囊癌细胞生物学行为的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录A 缩略词表
• 附录B 读研期间发表论文
• 附录C 综述
• 参考文献