广西猪链球菌2型毒力因子的研究

论文摘要

本研究建立了猪链球菌2型四个主要毒力因子Cps、MRP、EF、Sly的四重PCR检测方法,实验证明其特异性好,可检测的最低菌量为20CUF/ml,适合样品的大规模检测。应用以上建立的毒力因子四重PCR检测方法对138份广西猪链球菌2型菌株进行了检测,结果表明,127株分离自健康猪扁桃体的菌株的主要毒力基因型分属为:mrp+epf+sly+和mrp+epf+sly-共104株,占81.9%,mrp+epf-sly+有1株,mrp+epf-sly-有12株,mrp-epf-sly-有10株,共占18.1%。11株分离自病死猪器官的猪链球菌2型菌株毒力基因型都为mrp+epf+sly+。同时,对56株MRP基因PCR扩增呈阳性的菌株进行了部分测序,通过对核苷酸和推导氨基酸的同源性以及遗传进化系统树的分析,将这56个菌株分为2个基因型,即:Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型中包括:GX01、GX20-2、GX4Lin、GX6Lin、GXLP5、GXB30、GXB45、GXB102、GXB141、GXBM20、GXCDX23、GXCDX49、GXDL9、GXDL36、GXFS26、GXG42、GXG121、GXGG34、GXGL462、GXLB72、GXLB131、GXLP26、GXLS53、GXQL31、GXQP46、GXR147、GXRA63、GXWX193、GXWX209、GXWZ80、GXY134、GXY153、GXY160和GXZ22共34株。Ⅱ型包括:GX2Lin、GX11Lin、GXB74、GXB70、GXCLZ192、GXG6、GXGG35、GXGL547、GXHP99、GXJZ26、GXLJ122、GXQL11、GXQL25、GXR128、GXRA32、GXW32、GXW45、GXWX400、GXWZ241、GXYL12和GXYL16、GX12Lin共22株。Ⅱ型又可分成Ⅱa亚型和Ⅱb亚型,Ⅱa亚型包括:GX2Lin、GX11Lin、GXB74、GXB70、GXCLZ192、GXG6、GXGG35、GXGL547、GXHP99、GXJZ26、GXLJ122、GXQL11、GXQL25、GXR128、GXRA32、GXW32、GXW45、GXWX400、GXWZ241、GXYL12和GXYL16共21株。GX12Lin归为Ⅱb亚型。Ⅰ型中34株菌株有29株来自健康猪、5株来自发病猪,它们的核苷酸同源性在98.8%-99.9%之间,与江苏人源毒株98015核苷酸的同源性在99.0%-100%之间。22株Ⅱa亚型菌株中有20株来自健康猪、2株来自发病猪,它们的核苷酸同源性在98.0%-99.7%之间,与江苏人源毒株98015、71.9%-73.0%之间,Ⅱb亚型的GX12Lin株与Ⅱa亚型菌株的核苷酸同源性在82.5%-83.4%之间,江苏和四川人源毒株的核苷酸同源性在71.7%-72.5%之间,Ⅰ型菌株与Ⅱ型菌株核苷酸的同源性在71.1%-72.9%之间。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1、研究综述
• 1.1 猪链球菌2型的历史概况
• 1.2 猪链球菌2型的研究进展
• 1.2.1 猪链球菌2型流行病学研究
• 1.2.2 猪链球菌2型的形态结构和理化性质
• 1.2.3 猪链球菌的分类
• 1.2.4 猪链球菌2型的毒力因子
• 1.2.5 猪链球菌2型的致病机理
• 1.2.6 猪链球菌2型的检测方法
• 1.3 目的与意义
• 2、材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 阳性菌株
• 2.1.2 对照菌株
• 2.1.3 待检样品
• 2.1.4 MRP基因测序菌株
• 2.1.5 主要试剂及配制
• 2法）'>2.1.6 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.1.7 主要仪器
• 2.1.8 引物的设计与合成
• 2.1.9 参考毒株
• 2.2 方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 猪链球菌2型CPS、MRP、EF和Sly毒力因子四重PCR检测方法的建立
• 2.2.3 广西菌株毒力基因型的检测
• 2.2.4 对猪链球菌2型菌株mrp基因的克隆测序分析
• 3、实验结果
• 3.1 四重PCR检测方法的建立
• 3.1.1 单一PCR及多重PCR体系优化结果
• 3.1.2 特异性试验结果
• 3.1.3 敏感性试验结果
• 3.2 广西菌株毒力基因型的检测
• 3.3 猪链球菌2型MRP基因的扩增、克隆鉴定和序列分析
• 3.3.1 猪链球菌2型MRP基因的扩增和电泳胶回收结果
• 3.3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3.3 MRP基因核苷酸序列比对（见附表1）
• 3.3.4 MRP基因推导氨基酸序列的比较（见附表2）
• 3.3.5 MRP基因核苷酸遗传系统树分析（见图3-6）
• 4、讨论
• 4.1 毒力因子四重PCR检测方法的建立
• 4.2 广西猪链球菌2型菌株毒力基因型调查
• 4.3 猪链球菌2型MRP基因序列分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附表1 MRP基因核苷酸序列比对
• 附表2 MRP基因氨基酸序列比对
• 附表3 MRP基因核苷酸序列的同源性分析
• 附表4 MRP基因氨基酸序列的同源性分析
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文