补体C1q对Aβ1-40纤维诱导的BV-2小胶质细胞炎性反应的影响

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种多发于老年期和老年前期的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理学改变包括弥漫性大脑萎缩、β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein, Aβ）沉积形成的老年斑（senile plaques, SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）和大量的神经元丢失。伴随社会老龄化的进程,AD的发病率逐年上升,已成为严重危害人类健康的医学和社会问题。目前AD的病因和发病机制尚不十分清楚。研究表明,多种因素所导致的小胶质细胞激活引发的脑内炎症反应在AD的发生发展中扮演着重要的角色。而补体系统作为机体体液免疫的重要部分,也参与上述炎性反应过程。在AD患者大脑中,研究者发现补体经典途径早期成分C1、C2、C4等和补体活化最终形成的攻膜复合体（Membrane attack complex,MAC）的表达上调。除经典途径外,Strohmeyer等发现补体的替代通路也与AD的病理损害相关,免疫组化显示在AD患者大脑中替代通路关键因子B因子及D因子的存在。另外,较弱证据支持甘露聚糖结合凝集素（Mannan binding lectin,MBL）途径也参与其中,Lanzrein等发现在AD与对照组血清中,MBL并未有显著差异,但是在脑脊液中,AD患者MBL却有明显降低。然而补体各成分在AD发病过程所起作用目前仍不甚清楚。近年来对补体C1q的研究发现其可能起多种作用。部分学者发现其有毒性作用：报道称Clq通过与Ap多价结合,参与老年斑的成核过程。国内研究也发现C1q可能是导致脑内神经元氧化毒性及神经元死亡的因素之一。而部分学者则认为C1q有神经保护作用：Pisalyaput等通过体外实验证实C1q可以增强小胶质细胞吞噬Aβ,并且可以保护神经元细胞免受Aβ所致神经毒性。另外,有研究发现其能够抑制Ap和血清P蛋白所致的神经毒性。近来Deborah等则发现它还有利于小胶质细胞吞噬凋亡的神经元以及调节而后的炎性反应。然而,除此之外,补体C1q是否促进小胶质细胞所主导的颅内慢性炎性反应呢?这是可能的,因为补体C1q可能促进Aβ与小胶质细胞的结合。首先,补体Clq既能与Ap结合（如上文所述）,又能与小胶质细胞结合。现已有人证实小胶质细胞上存在C1q的受体C1qR。其次,补体Clq、Aβ与小胶质细胞等三者在AD患者脑组织中位置上很接近。免疫组化显示老年斑周围也即沉积的Ap纤维周围存在活化的小胶质细胞和补体Clq。那么,补体C1q就有可能通过与Aβ和小胶质细胞的相互结合促进后两者的结合,从而促进小胶质细胞的活化以及而后的炎性反应。我们的研究采用不浓度C1q和同一浓度Ap纤维刺激BV-2细胞,并且利用C1qA（可以竞争性与Aβ的结合）进行阻断试验,最终测定BV-2细胞的活化程度—CD45的表达以及炎性因子TNF-α、IL-6蛋白及mRNA的表达水平。BV-2细胞CD45的表达采用流式细胞技术;TNF-α、IL-6蛋白浓度采用ELISA技术,方法参照TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒内所附的操作说明；TNF-α、IL-6的mRNA测定采用定量PCR技术,方法参照相应定量PCR说明书进行。检测结果显示,补体C1q上调了BV-2细胞CD45的表达,增加了TNF-α蛋白及其mRNA的表达,而IL-6在加入补体C1q后无显著性变化。[材料和方法]1.材料BV-2小胶质细胞购自于中国科学院上海细胞库；淀粉样蛋白Aβ1-40（美国Sigma公司）；补体C1q（以色列Prospec公司）；补体C1qA（中国台湾Abnova公司）；CCK-8试剂（日本株式会社同仁化学研究所）；IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒（奥地利Bender公司）；NP40（美国Cayman公司）；定量PCR试剂盒（美国复能基因公司）。2.方法2.1 BV-2细胞的培养BV—2细胞在37℃水浴后,经1000rpm离心5分钟去除冻存液,然后置入25cm2培养瓶,在37℃、5%C02条件下,用含10%FCS的DMEM高糖培养基培养细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代。2.2聚集状态Aβ1-40的制备与鉴定用无菌去离子水将Aβ1-40稀释成lmg/mL,37℃孵育7天,使其变为纤丝状聚集的Aβ。然后取5μl上述液体滴于含碳支持膜200目去离子铜网上,空气干燥1分钟后,用2%醋酸双氧铀负染1分钟,使用透射电镜观察。2.3细胞存活率测定重悬培养瓶中BV-2小胶质细胞,以5×105/ml接种于96孔培养板中,分为7个实验组、1个阳性对照组和1个空白组,每组含3孔,继续培养12h后,各实验组分别加入阳性对照组脂多糖LPS（1μg/L）,实验组Aβ1-40（100mg/L）,C1q （10nmol/L）, C1q （50nmol/L）,Aβ1-40 （100mg/L）+C1q （10nmol/L）,Aβ1-40 （100mg/L）+C1q （50nmol/L）,Aβ1-40 （100mg/L）+C1q （10nmol/L）+C1qA （10nmol/L）, Aβ1-40 （100mg/L）+C1q （50nmol/L） +C1qA（50nmol/L）,空白组则不加（其中含有两个药物及以上的组加药前先将所加药物混合,并在37℃下孵育1h）,培养24 h后去除上清夜,加入100μl含有10%CCK-8的培养基后继续培养2h,最后用酶标仪在450nm波长下测每一孔的吸光度,按公式计算出各孔细胞存活率。2.4各实验组BV-2细胞CD45表达测定在6孔板中重复进行上述处理过程,培养24 h后吸除上清液并加入0.25%胰酶消化细胞,待消化完吸除胰酶,加入1ml预冷PBS液使细胞重悬,然后移至1.5ml离心管中,2000rpm离心5min,吸除上清后再加入200μl PBS液重悬细胞,仍2000rpm离心5min,并重复两次,然后用100μl PBS重悬细胞,并在加入2μl大鼠抗小鼠CD45流式抗体,混匀至4℃冰箱孵育30min,然后按上述过程用PBS再清洗细胞3次后使用流式细胞仪测定表达CD45的BV-2细胞数量。2.5各实验组上清液及细胞裂解液IL-6、TNF-α的测定在24孔板中重复进行上述处理过程,培养24 h后吸取上清液并储存于-20℃冰箱中,然后用PBS清洗孔内细胞,并在清洗后向每孔加入200μl含0.5%NP40的PBS液裂解细胞,最后将细胞裂解液离心后取上清也置于-20℃冰箱中保存。检测时将所有标本从冰箱中取出,融化后将所有标本经3000rpm离心20分钟,余步骤按ELLISA试剂盒说明书进行,最后用酶标仪在450nm波长下测吸光度（A）值,绘制标准曲线,根据曲线计算IL-6、TNF-α的浓度。2.6各实验组IL-6、TNF-α的mRNA测定在6孔板中重复进行上述处理过程,培养24 h后吸除上清液,利用TRIZOL法提取总RNA并测定RNA浓度,余实验按复能公司提供的定量PCR试剂盒说明书进行。3.统计学分析计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,结果用单因素方差分析（One-way ANOVA）方法,方差齐性用LSD法进行组间多重比较,方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被定为有统计学差异。[结果]1.各组BV-2细胞细胞存活率比较结果各实验组BV-2小胶质细胞细胞存活率比较差异无统计学意义（F=2.020,P=0.103）。2.各组BV-2细胞CD45表达比较结果流式细胞术检测到各组均有不同数量BV-2小胶质细胞表达CD45。各实验组BV-2小胶质细胞表达CD45数量有显著性差异（F=59.031,P=0.000）。其中,经LPS（1μg/L）处理后,BV-2小胶质细胞表达CD45的数目较其他各组增加,差异具有统计学意义（P<0.05）；另经Aβ1-40 （100mg/L）+C1q （50nmol/L）处理后BV-2小胶质细胞表达CD45的数量较LPS组外各组增加,较LPS组降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.各组上清液及细胞裂解液中IL-6、TNF-α浓度比较结果3.1各组上清液及细胞裂解液中IL-6浓度的测定值：各实验组上清液及细胞裂解液中IL-6浓度比较差异具有统计意义（上清液IL-6浓度比较F=77.838,P=0.000；细胞裂解液中IL-6浓度比较F=24.038,P=0.000）。其中经LPS处理后,BV-2细胞上清液及细胞裂解液中测得的IL-6浓度较与其余各组相比明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,其余各组上清液及细胞裂解液中IL-6浓度相互比较差异无统计学意义（P>0.05）。3.2各组上清液及细胞裂解液中TNF-a浓度的测定值：各实验组上清液及细胞裂解液中TNF-α浓度比较差异具有统计学意义（上清液TNF-a浓度比较F=157.891,P=0.000；细胞裂解液中TNF-α浓度比较F=166.897,P=0.000）。其中经LPS,BV-2小胶质细胞上清液及其细胞裂解液中TNF-a浓度与其余各组相比增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。除此之外,经Aβl-40（100mg/L）+C1q（50nmol/L）处理后,与除LPS外各组相比上清液中测得的TNF-a增加,较LPS组减少,其差异均具有有统计学意义（P<0.05）。4.各组IL-6、TNF-a的mRNA表达比较结果4.1各组BV-2小胶质细胞IL-6 mRNA表达水平：各实验组IL-6 mRNA表达水平比较差异具有统计学意义（F=66.743,P=0.000）。其中经LPS处理后,BV-2小胶质细胞IL-6 mRNA表达水平较其他组升高,差异具有统计学意义（P<0.05）；而其他各组比较无统计学差异（P>0.05）4.2各组BV-2小胶质细胞TNF-αmRNA表达水平：各实验组TNF-αmRNA表达水平比较差异具有统计学意义（F=65.695,P=0.000）。其中经LPS处理后,BV-2小胶质细胞TNF-αmRNA表达水平较其他组升高,差异具有统计学意义（P<0.05）；而经Aβ1-40 （100mg/L）+C1q （50nmol/L）处理后,BV-2小胶质细胞TNF-αmRNA表达水平较LPS组低,较其余各组升高,差异均具有统计学意义（P<0.05）[结论]一、补体C1q增强Aβ对小胶质细胞的活化作用。二、补体C1q增强Aβ所致小胶质细胞的炎性反应,即在补体Clq和AD共同干预下小胶质细胞分泌TNF-a水平明显增加。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 A β1-40纤维制作与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 BV-2细胞活性及其上清液、细胞裂解液炎症介质蛋白和mRNA测定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三章 BV-2细胞CD45表达测定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 缩略词表
• 发表论文一览表
• 致谢