丙谷二肽的酶促合成研究

论文摘要

本文以重要的肠外营养用药——丙谷二肽的酶法制备为核心内容,设计完成了包括引入保护基、催化肽键合成、脱保护基三步构成的完整合成工艺路线,并对主要酶促合成工艺条件进行了分析优化;在此基础上,引入CLEA技术,对合成中涉及的两种重要酶制剂——木瓜蛋白酶和青霉素G酰化酶进行新型固定化酶技术开发,优化制备条件,考察催化性质,表征形貌结构;同时,开展CLEA微囊化方法的探索研究,为丙谷二肽的高收率、低成本制备提供有益参考,主要研究结果如下:酶促合成丙谷二肽:以木瓜蛋白酶和青霉素G酰化酶为主要反应用酶,成功制得丙谷二肽;全套反应由引入保护基、木瓜蛋白酶酶促肽键合成和青霉素G酰化酶催化脱保护三步构成,各步反应收率最终为86.41%,30.5%和94.8%,总收率为24.98%。;合成过程中,采用HPLC-MS、核磁等手段对产物进行检测鉴定;同时,开发了以制备色谱为主的目标物分离提纯方法。木瓜蛋白酶催化phac-Ala-Gln的合成:反应由动力学控制,通过优化工艺条件,得出在pH8.8,25℃,助溶剂乙醇添加量为1.5mL,游离酶浓度0.02 g/mL,Gln浓度0.5mol/L,Phac-Ala-OMe浓度0.05mol/L,添加KCl浓度为0.1mol/L,反应160min情况下,合成苯乙酰基保护的丙谷二肽收率最高,可达30.5%;将木瓜蛋白酶CLEA应用于反应,15h时收率为9.32%;针对CLEA技术应用中存在的颗粒较小,不利于工业化应用的问题,提出囊化解决方案,制得6种木瓜蛋白酶CLEA微囊,对结构性质进行表征,其中实心海藻酸钙微囊酶活保留最高,达53.42%。青霉素G酰化酶催化脱保护基生成Ala-Gln:将青霉素G酰化酶游离酶应用于Ala-Gln的合成,反应0.33h,收率达94.8%;制备得到青霉素G酰化酶CLEA,优化条件为:饱和硫酸铵溶液为沉淀剂,与酶液体积比为2.3:1时为最适用量,戊二醛为交联剂,浓度0.35%,交联时间为2h,温度4℃,最终酶活保留可达52.61%;所得CLEA的最适温度与游离酶相比提高了10℃,因此可以在较高温度下应用;最适pH与游离酶相比向碱性偏移了两个单位,适用范围拓宽;热失活研究表明,高温下青霉素G酰化酶CLEA的热稳定性比游离酶明显提高,反应1.0h,收率为95.6%;实验制得两种青霉素G酰化酶CLEA微囊,其中中空微囊酶活保留可达16.84%,机械强度最高可达7.95 N;将青霉素G酰化酶CLEA微囊应用于反应,2.2h时,收率为95.2%。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 活性多肽合成方法及酶促多肽合成研究现状
• 1.1.1 活性多肽简介
• 1.1.2 酶促活性多肽合成
• 1.1.3 丙谷二肽的合成
• 1.2 固定化酶的研究进展
• 1.2.1 固定化酶概述
• 1.2.2 酶的固定化方法
• 1.3 本文研究内容
• 第二章 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成探索
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 实验材料和仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 丙氨酸甲酯的苯乙酰基保护生成苯乙酰基-L-丙氨酸甲酯
• 2.3.2 游离木瓜蛋白酶催化合成苯乙酰基丙谷二肽
• 2.3.3 游离青霉素G酰化酶催化生成丙谷二肽
• 2.4 小结
• 第三章 木瓜蛋白酶催化合成Phac-Ala-Gln的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 实验材料和仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 游离木瓜蛋白酶催化合成Phac-Ala-Gln反应条件的优化
• 3.3.2 木瓜蛋白酶交联酶聚体应用于催化合成Phac-Ala-Gln
• 3.3.3 木瓜蛋白酶CLEA微囊的制备及酶活测定
• 3.4 小结
• 第四章 青霉素G酰化酶催化脱保护基生成丙谷二肽的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料方法
• 4.2.1 实验材料和仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 游离酶反应时间及产率
• 4.3.2 青霉素G酰化酶交联酶聚体的制备及反应应用
• 4.3.3 青霉素G酰化酶CLEA的微囊化研究及反应应用
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢