利用离子束诱变筛选大肠杆菌Tat转运系统受阻的突变株

论文摘要

本研究通过低能 N 离子注入处理大肠杆菌野生型菌株 MC4100A,利用其蚀刻效应和诱变效应将外源质粒直接导入菌体中、根据 Tat 转运系统相关基因的缺失型菌株分裂后分离功能的异常,tat 突变型菌株对 SDS 的敏感性以及在 M9 培养基中生长性能为指标,筛选 Tat 蛋白质转运系统受阻的突变菌株。 经低能 N 离子注入处理后,转入质粒 p8760,并筛选到了 7 株与 MC4100A 相比有很大差异的转化子,这些转化子细胞呈链状排列,丧失了细胞分裂后分离的能力;2%SDS 对其有一定的杀伤性;在厌氧状态下,失去了以甘油为碳源和 TMAO 为电子受体的生长能力。表明这 7 株突变株具有一系列与双精氨酸转运系统受阻菌株相同的性状,因而这些突变很可能发生在与细菌蛋白质 Tat 转运系统相关的基因上。并且突变菌株在 37℃下生长缓慢,难以形成菌落,而在 4℃放置 3d,可形成直径约为0.5mm 的菌落。 通过十二烷基磺酸钠(SDS)、紫外线(UV)、三黄片(SHP)、反复冻融 4 种物化方法对大肠杆菌 MC4100A/p8760 菌株进行质粒消除。摸索了 DNA 在非损伤条件下的消除规律,并获得了几株质粒消除的菌株。同时用 M9 培养基培养和镜检两种方法检验了质粒消除后菌株的基本特性。结果表明,质粒消除没有改变突变菌株的性状。 现将编码 tat 基因的质粒 p8737 转入质粒已消除的菌株中,进行互补检测。结果表明,导入质粒 p8737 后,菌株的形态没有恢复,且在 M9 培养基中仍不能生长,说明不能互补。这初步确定了这些突变菌株为 Tat 转运系统的相关基因发生突变,而非 tat 基因。 为了构建基因文库,确定突变菌株的具体突变位点。提取 MC4100A 菌株的核DNA;测定基因组 DNA 的纯度;选用限制性内切酶 MobⅠ进行酶切,电泳,观察酶切效果。对实验结果进行分析表明,大肠杆菌基因组甲基化程度较高,因此 MobⅠ对其没有酶切效果。 总之,离子注入可以介导外源质粒进入微生物细胞并能引起诱变效应。故低能N离子注入对微生物细胞的诱变效应和介导外源DNA转化效应的有机结合将使离子注入技术在生物学基础研究中有着广泛的应用前景。本研究筛选到了一株非已知大肠杆菌 tat 基因编码的 Tat 系统受阻的突变菌株,说明除了已知编码 Tat 系统的几种蛋白质之外,必定还有其它的成分参与蛋白质的转运,这无疑对完善 Tat 转运系统的组成,建立完善的转运模型和了解其机理奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 综述
• 第一章 引言
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 研究内容
• 第二章 料料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 N 离子诱变及外源DNA 的转化
• 3.2 筛选突变菌株
• 3.3 SDS敏感菌株的分析
• 3.4 生长特性的研究
• 3.5 菌株质粒的消除
• 3.6 质粒消除菌株性状的检验
• 3.7 突变菌株突变类型的检验
• 3.8 基因文库的构健
• 第四章 讨论
• 4.1 离子束诱变及外源基因的转化
• 4.2 筛选突变菌株
• 4.3 突变菌株性状的检测
• 4.4 质粒消除
• 4.5 基因互补测验
• 4.6 基因文库的构健
• 第五章 结论与建议
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 在读期间发表的学术论文