黏着斑激酶相关非激酶对肝星状细胞胶原代谢的调控作用

论文摘要

肝纤维化（hepatic fibrosis）是多种致病因子引起慢性肝病,进而发展为肝硬化的共同病理途径,其实质是肝脏内病理性细胞外间质（extracellular matrix, ECM）的合成和降解失衡,表现为ECM的大量沉积,其中胶原占沉积ECM的80 %以上,胶原中的Ⅰ型胶原占沉积ECM的70 %以上。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）是胶原合成和降解的关键细胞,因此调控HSC的胶原代谢是预防和逆转肝纤维化的关键。HSC的胶原合成和降解主要受基质金属蛋白酶调控,MT1-MMP（membrane-type matrix metalloproteinase-1, MT1-MMP）是近年新发现的可以降解Ⅰ型胶原的膜型基质金属蛋白酶,它还可以通过激活MMP2（matrix metalloproteinase-2, MMP2）来促进胶原的降解;TIMP-2（tissue inhibitors of matrix metalloproteinasea-2, TIMP-2）是MT1-MMP和MMP2的共同抑制因子,它可以通过抑制二者对胶原的降解上调胶原的合成。HSC的胶原代谢受多条信号转导通路调节,粘着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）处于整合素、生长因子等信号通路的交汇点。基础研究表明,FAK磷酸化后,对多种类型细胞的胶原代谢具有重要影响,其第397酪氨酸位点（Tyr397）是自主磷酸化位点,该位点磷酸化后,可以顺次激活其余磷酸化位点,放大FAK催化活性。因此,可以说,Tyr397是FAK发挥生物学功能的扳机点。FAK的C-末端含有粘着斑激酶相关非激酶（FAK-related non-kinase,FRNK）,FRNK可以作为FAK的一种内源性抑制因子,参与体内FAK功能的负向调节。对许多细胞类型来说,FRNK的过量表达能够影响其胶原代谢,但是FRNK对HSC胶原代谢的影响及其调控机制尚不清楚。为此,我们应用体外细胞培养技术,在脂质体介导下将FRNK质粒瞬时转染HSC,研究选择性抑制FAK磷酸化对纤维连接蛋白（fibronectin,FN）刺激的HSC胶原代谢的影响,以及该过程中某些信号转导分子的作用。目的应用FRNK质粒瞬时转染HSC,探讨FRNK选择性抑制FAK磷酸化对FN刺激的HSC胶原代谢的影响,以及该过程中MMP2、TIMP-2、MT1-MMP的表达变化。方法应用含2 %胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1 HEPES的RPMI 1640培养液,37℃、5 % CO2条件下体外培养HSC。以FN刺激HSC增殖,根据Lipofectamine? Reagent提供的实验操作步骤,在脂质体介导下进行FRNK质粒转染。实验分5组:①对照组（Con组）;②FN组（FN组）;③脂质体组（Lip组）;④空质粒组（nFRNK组）;⑤FRNK质粒组（FRNK组）。②～⑤组中FN浓度均为50μg·mL-1。采用3H脯氨酸掺入技术测定各组HSC总胶原和Ⅰ型胶原的合成;Western blot及RT-PCR共扩增技术检测FRNK、MMP2、TIMP-2、MT1-MMP蛋白及其mRNA表达。结果1 FRNK成功转染HSC:Western blot显示,在125 kD位置出现FAK杂交带,光密度值分析结果显示,FAK蛋白表达量于转染后0 h、24 h、48 h、72 h无明显变化,P>0.50。同时在42 kD处出现FRNK杂交带,随转染时间延长,FRNK表达逐渐增强,转染后48 h表达最强,72 h减弱,经统计学处理有显著性差异,P<0.01。说明FRNK转染HSC成功,于转染后48 h其表达最强,而FAK蛋白表达在转染前后无明显变化。2 FRNK抑制HSC总胶原的合成:采用3H脯氨酸掺入技术测定各组HSC总胶原的合成,发现经FN处理后,FN组总胶原的合成显著高于对照组,P<0.01,FN组、脂质体组与空质粒组无显著差异,P>0.05;而在FRNK转染HSC 48 h后总胶原的合成较空质粒组有显著下降,P<0.01。表明在FN刺激下HSC总胶原的合成增加,用FRNK转染FN刺激的HSC可有效抑制其总胶原的合成。3 FRNK抑制HSCⅠ型胶原的合成:采用3H脯氨酸掺入技术测定各组HSCⅠ型胶原的合成,发现经FN处理后,FN组Ⅰ型胶原的合成显著高于对照组,P<0.05,FN组、脂质体组与空质粒组无显著差异,P>0.05;而在FRNK转染HSC 48 h后Ⅰ型胶原的合成较空质粒组有显著下降,P<0.01。表明在FN刺激下HSCⅠ型胶原的合成增加,用FRNK转染FN刺激的HSC可有效地抑制其Ⅰ型胶原的合成。4 FRNK上调MT1-MMP表达:Western blot显示在66kD位置出现一条杂交带,经光密度测定分析显示:FN刺激后,HSC MT1-MMP蛋白表达量明显低于对照组（1.02±0.18 vs 1.55±0.27）,降低了34.19 %,P<0.01;但与脂质体组、空质粒组比较无明显差异,P>0.05。FRNK质粒转染HSC 48 h后,MT1-MMP蛋白表达量显著升高（2.25±0.54 vs 0.99±0.88）,较空质粒组升高51.77%,经统计学处理有显著性差异,P<0.01。FRNK质粒转染HSC 10 h后,RT-PCR共扩增检测MT1-MMP和内参照β-actin的基因表达,扫描结果分析显示:FN刺激后,HSC MT1-MMP mRNA表达量明显低于对照组（0.99±0.14 vs 1.26±0.17）,P<0.01。FN组、脂质体组与空质粒组之间无明显差异,P>0.50;FRNK质粒组MT1-MMP mRNA表达较空质粒组明显增加（1.58±0.18 vs 1.00±0.10）,有明显统计学意义,P<0.01。5 FRNK上调MMP2的表达:Western blot显示在62 kD位置出现一条杂交带,经光密度测定分析显示:FN刺激后,HSC MMP2蛋白表达量明显低于对照组（1.13±0.17 vs 1.46±0.20）,降低了22.60 %,P<0.01;但与脂质体组、空质粒组比较无明显差异,P>0.05。FRNK质粒转染HSC 48 h后,MMP2蛋白表达量显著升高（2.26±0.14 vs 1.09±0.15）,较空质粒组升高51.77%,经统计学处理有显著性差异,P<0.01。FRNK质粒转染HSC 10 h后,RT-PCR共扩增检测MMP2和内参照β-actin基因表达,扫描结果分析显示:FN刺激后,HSC MMP2 mRNA表达量明显低于对照组（0.97±0.07 vs 1.26±0.10）,P<0.01。FN组、脂质体组与空质粒组之间无明显差异,P>0.50;FRNK质粒组MMP2 mRNA表达较空质粒组明显增加（1.65±0.04 vs 0.99±0.03）,有明显统计学意义,P<0.01。6 FRNK抑制TIMP-2蛋白表达:Western blot显示在21 kD位置出现一条杂交带,经光密度测定分析显示:FN刺激后,HSC TIMP-2蛋白表达量明显高于对照组（2.26±0.13 vs 1.44±0.09）,升高了36.28 %,P<0.01;但与脂质体组、空质粒组比较无明显差异,P>0.05。FRNK质粒转染HSC 48 h后,TIMP-2蛋白表达量显著降低（1.14±0.10 vs 2.23±0.15）,较空质粒组升高48.88%,经统计学处理有显著性差异,P<0.01。FRNK质粒转染HSC 10 h后,RT-PCR共扩增检测TIMP-2和内参照β-actin基因表达,扫描结果分析显示,FN刺激后,HSC MMP2蛋白表达量明显低于对照组,P<0.01。FN组、脂质体组与空质粒组之间无明显差异,P>0.50;FRNK质粒组TIMP-2 mRNA表达较空质粒组明显降低（0.97±0.04 vs 1.69±0.04）,有明显统计学意义,P<0.01。7 MMP2/TIMP-2比值升高:分别把各组中MMP2、TIMP-2翻译和转录水平的表达作一比值,可见在翻译和转录水平,外源性的FRNK在HSC中大量表达后升高了MMP2/TIMP-2比值。结论在脂质体介导下瞬时转染含FRNK的质粒,可使外源性的FRNK在HSC内大量表达,呈时间依赖性关系;并可以抑制FN刺激的HSC总胶原和Ⅰ型胶原的合成,此可能与FRNK上调MT1-MMP的表达和MMP2/TIMP-2比值有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文黏着斑激酶相关非激酶对肝星状细胞胶原代谢的调控作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述黏着斑激酶对胶原代谢的调控作用
• 致谢
• 个人简历