乳腺癌阅读框架内噬菌体文库的构建

论文摘要

目前,癌症依然是当今世界的难题,全世界发病率最高的癌症是肺癌,其次是乳腺癌,随着生态环境的恶化和生活节奏的加快,癌症在人群中的发病率逐年增高,每年大约新增100万癌症患者,而早期诊断和早期治疗已经被医学界认为是解决癌症最有效的方法。肿瘤标志物是反映肿瘤存在和生长的一类物质,通过肿瘤标志物相关参数的变化可以获得大量的肿瘤生长信息,也为早期癌症诊断提供了依据.噬菌体表面展示技术在癌症肿瘤标志物的筛选中得到广泛应用,用pKE-2质粒经卡那抗性筛选富集开放阅读框架（open-reading frame ORF）内阳性克隆,构建阅读框架内乳腺癌噬菌体表面展示文库可以提高筛选效率。方法：用Trizol试剂提取乳腺癌组织总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ和HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的pKE-2质粒载体,转化大肠杆菌DH5a,经卡那抗性筛选,富集ORF克隆.回收ORF内双链cDNA片段,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5615为受体菌构建T7噬菌体展示文库。结果：经过ORF筛选,文库中ORF克隆比例达到80%,较筛选前的5%提高75%。经测定,文库滴度为2.85×105pfu／mL,重组率为99%,扩增后文库滴度为2.65×109pfu／mL。对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,大部分插入片段在0.25-1kb之间。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 癌症的病因和危害
• 1.2 肿瘤标志物的基本知识
• 1.2.1 肿瘤标志物的定义
• 1.2.2 乳腺癌肿瘤标志物
• 1.2.3 肿瘤标志物的筛选
• 1.3 噬菌体展示技术概述
• 1.3.1 λ噬菌体展示系统
• 1.3.2 单链丝状噬菌体展示系统
• 1.3.3 T4噬菌体展示系统
• 1.3.4 T7噬菌体展示系统
• 1.4 噬菌体展示文库的应用
• 1.4.1 构建噬菌体抗体库
• 1.4.2 噬菌体展示技术用于抗原表位的研究
• 1.4.3 噬菌体展示技术用于各种疾病的研究
• 1.4.4 噬菌体展示技术用于新型疫苗的研究
• 1.5 开放阅读框架的筛选
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第2章 乳腺癌双链CDNA的合成
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 乳腺癌组织
• 2.1.1.2 生化试剂及试剂盒
• 2.1.1.3 耗材与主要实验仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 乳腺癌组织的获取及保存
• 2.1.2.2 总RNA提取
• 2.1.2.3 mRNA分离纯化
• 2.1.2.4 cDNA合成及末端平端化
• 2.1.2.5 加EcoR Ⅰ/HindⅢ接头
• 2.2 结果
• 2.2.1 总RNA提取结果
• 2.2.2 mRNA分离结果
• 2.2.3 dscDNA合成结果
• 2.3 讨论
• 第3章 质粒PKE-2载体的制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备
• 3.1.2.2 pKE-2文库质粒的扩增
• 3.1.2.3 pKE-2文库质粒的提取和电泳检测
• 3.1.2.4 pKE-2文库质粒的双酶切及鉴定
• 3.1.2.5 pKE-2质粒载体的回收
• 3.2 结果
• 3.2.1 pKE-2载体的提取结果
• 3.2.2 pKE-2载体的酶切纯化回收结果
• 3.3 讨论
• 第4章 T7噬菌体载体的制备
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 T7噬菌体宿主菌的培养
• 4.1.2.2 T7噬菌体的扩增
• 4.1.2.3 T7噬菌体DNA的提取-酚抽法
• 4.1.2.4 T7噬菌体DNA的双酶切及纯化
• 4.1.2.5 T7载体的回收
• 4.2 结果
• 4.2.1 T7噬菌体DNA的电泳鉴定
• 4.2.2 T7噬菌体DNA纯度的测定
• 4.2.3 双酶切后T7 DNA纯度的测定
• 4.3 讨论
• 第5章 阅读框架内克隆的筛选及鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 双链cDNA与pKE-2载体的连接
• 5.1.2.2 转化大肠杆菌DH5a
• 5.1.2.3 菌落PCR并测序鉴定
• 5.1.2.4 阳性克隆的收集保存及ORF内cDNA片段的获取
• 5.2 结果
• 5.2.1 卡那霉素抗性筛选效率
• 5.2.2 ORF内cDNA片段的获取
• 5.3 讨论
• 第6章 噬菌体展示文库的包装及鉴定
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 cDNA片段与T7载体的链接及体外包装
• 6.1.2.2 T7噬菌体展示文库的鉴定
• 6.2 结果
• 6.2.1 初始噬菌体文库的滴度
• 6.2.2 扩增后噬菌体文库的滴度
• 6.2.3 PCR鉴定文库插入片段分布情况
• 6.2.4 测序结果
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文
• 致谢