论文摘要
目前,癌症依然是当今世界的难题,全世界发病率最高的癌症是肺癌,其次是乳腺癌,随着生态环境的恶化和生活节奏的加快,癌症在人群中的发病率逐年增高,每年大约新增100万癌症患者,而早期诊断和早期治疗已经被医学界认为是解决癌症最有效的方法。肿瘤标志物是反映肿瘤存在和生长的一类物质,通过肿瘤标志物相关参数的变化可以获得大量的肿瘤生长信息,也为早期癌症诊断提供了依据.噬菌体表面展示技术在癌症肿瘤标志物的筛选中得到广泛应用,用pKE-2质粒经卡那抗性筛选富集开放阅读框架(open-reading frame ORF)内阳性克隆,构建阅读框架内乳腺癌噬菌体表面展示文库可以提高筛选效率。方法:用Trizol试剂提取乳腺癌组织总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ和HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的pKE-2质粒载体,转化大肠杆菌DH5a,经卡那抗性筛选,富集ORF克隆.回收ORF内双链cDNA片段,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5615为受体菌构建T7噬菌体展示文库。结果:经过ORF筛选,文库中ORF克隆比例达到80%,较筛选前的5%提高75%。经测定,文库滴度为2.85×105pfu/mL,重组率为99%,扩增后文库滴度为2.65×109pfu/mL。对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,大部分插入片段在0.25-1kb之间。
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摘要Abstract第1章 文献综述1.1 癌症的病因和危害1.2 肿瘤标志物的基本知识1.2.1 肿瘤标志物的定义1.2.2 乳腺癌肿瘤标志物1.2.3 肿瘤标志物的筛选1.3 噬菌体展示技术概述1.3.1 λ噬菌体展示系统1.3.2 单链丝状噬菌体展示系统1.3.3 T4噬菌体展示系统1.3.4 T7噬菌体展示系统1.4 噬菌体展示文库的应用1.4.1 构建噬菌体抗体库1.4.2 噬菌体展示技术用于抗原表位的研究1.4.3 噬菌体展示技术用于各种疾病的研究1.4.4 噬菌体展示技术用于新型疫苗的研究1.5 开放阅读框架的筛选1.6 本研究的目的和意义第2章 乳腺癌双链CDNA的合成2.1 材料与方法2.1.1 材料2.1.1.1 乳腺癌组织2.1.1.2 生化试剂及试剂盒2.1.1.3 耗材与主要实验仪器2.1.2 方法2.1.2.1 乳腺癌组织的获取及保存2.1.2.2 总RNA提取2.1.2.3 mRNA分离纯化2.1.2.4 cDNA合成及末端平端化2.1.2.5 加EcoR Ⅰ/HindⅢ接头2.2 结果2.2.1 总RNA提取结果2.2.2 mRNA分离结果2.2.3 dscDNA合成结果2.3 讨论第3章 质粒PKE-2载体的制备3.1 材料与方法3.1.1 材料3.1.2 方法3.1.2.1 大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备3.1.2.2 pKE-2文库质粒的扩增3.1.2.3 pKE-2文库质粒的提取和电泳检测3.1.2.4 pKE-2文库质粒的双酶切及鉴定3.1.2.5 pKE-2质粒载体的回收3.2 结果3.2.1 pKE-2载体的提取结果3.2.2 pKE-2载体的酶切纯化回收结果3.3 讨论第4章 T7噬菌体载体的制备4.1 材料与方法4.1.1 材料4.1.2 方法4.1.2.1 T7噬菌体宿主菌的培养4.1.2.2 T7噬菌体的扩增4.1.2.3 T7噬菌体DNA的提取-酚抽法4.1.2.4 T7噬菌体DNA的双酶切及纯化4.1.2.5 T7载体的回收4.2 结果4.2.1 T7噬菌体DNA的电泳鉴定4.2.2 T7噬菌体DNA纯度的测定4.2.3 双酶切后T7 DNA纯度的测定4.3 讨论第5章 阅读框架内克隆的筛选及鉴定5.1 材料与方法5.1.1 材料5.1.2 方法5.1.2.1 双链cDNA与pKE-2载体的连接5.1.2.2 转化大肠杆菌DH5a5.1.2.3 菌落PCR并测序鉴定5.1.2.4 阳性克隆的收集保存及ORF内cDNA片段的获取5.2 结果5.2.1 卡那霉素抗性筛选效率5.2.2 ORF内cDNA片段的获取5.3 讨论第6章 噬菌体展示文库的包装及鉴定6.1 材料与方法6.1.1 材料6.1.2 方法6.1.2.1 cDNA片段与T7载体的链接及体外包装6.1.2.2 T7噬菌体展示文库的鉴定6.2 结果6.2.1 初始噬菌体文库的滴度6.2.2 扩增后噬菌体文库的滴度6.2.3 PCR鉴定文库插入片段分布情况6.2.4 测序结果6.3 讨论参考文献研究生期间发表的论文致谢
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标签:乳腺癌论文; 开放阅读框架论文; 卡那霉素抗性论文; 质粒载体论文; 噬菌体展示文库论文;