N-连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究

论文摘要

蛋白质糖基化在许多生物和生理过程中发挥着重要的作用,进行蛋白质糖基化的分析在蛋白质组学以及药物筛选的研究中具有重要的意义。本论文分别以寡糖链、糖肽以及整个糖蛋白（糖形）为分析对象,进行以微流控芯片和质谱或者二者联用为基础的N-连接蛋白质糖基化分析平台和方法的研究。主要内容包括:在微流控芯片上实现了简单糖的快速电泳分离和直接、间接激光诱导荧光检测;发展了以芯片电泳与外切糖苷酶酶解结合,激光诱导荧光检测为基础,以糖肽为分析对象的糖链结构类型分析方法,对火鸡卵白蛋白的糖链结构进行推测,结果表明该蛋白含有高甘露糖型和杂合型的糖链;设计并制备了一种集成化凝集素亲和微流控芯片。在通道内构建以整体材料为载体的微米级的凝集素亲和柱,以电渗流为驱动力,在微流控芯片上实现了传统凝集素亲和色谱的全过程,用豌豆凝集素亲和芯片对糖蛋白的糖形进行分析,根据其糖链与豌豆凝集素结合能力的不同将糖形分为与该凝集素不结合、弱结合和强结合的组分。该芯片具有耗样量少、分析快速以及操作简单的优点。构建了联接芯片电泳和质谱的鞘流液辅助的纳米电喷雾接口。用该接口将芯片电泳与离子阱质谱连接,实现了糖蛋白中糖肽结构的具体分析;建立了用基质辅助激光解吸-时间飞行-质谱（MALDI-TOF-MS）对从糖蛋白释放下来的糖链进行结构分析的方法,用该方法进行了不同来源的同种糖蛋白-鸡卵白蛋白和火鸡卵白蛋白糖链结构的比较分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 导论（文献综述）
• 第一章 N-连接蛋白质糖基化分析进展
• 1.1 引言
• 1.2 N-连接糖基化介绍
• 1.2.1 N-连接糖基化特点
• 1.2.2 N-连接糖链的分类
• 1.3 N-连接糖基化的分析策略
• 1.3.1 以二维凝胶电泳为基础的分析策略
• 1.3.2 以凝集素亲和色谱为基础的分析策略
• 1.3.3 其他的分析策略
• 1.4 N-连接糖基化的现代分析技术
• 1.4.1 高效液相色谱
• 1.4.1.1 糖链的高效液相色谱分析
• 1.4.1.1.1 反相液相色谱
• 1.4.1.1.2 正相液相色谱
• 1.4.1.1.3 石墨液相色谱
• 1.4.1.2 糖肽的高效液相色谱分析
• 1.4.1.2.1 富集技术
• 1.4.1.2.2 液相色谱分离
• 1.4.2 凝集素亲和色谱
• 1.4.3 毛细管电泳
• 1.4.3.1 毛细管电泳对糖形以及寡糖的分离
• 1.4.3.2 毛细管电泳/质谱
• 1.4.3.3 亲和毛细管电泳
• 1.4.4 微流控芯片
• 1.4.4.1 芯片电泳
• 1.4.4.2 微流控芯片/质谱
• 1.4.4.3 集成化微流控芯片
• 1.4.5 质谱
• 1.4.5.1 快原子轰击质谱
• 1.4.5.2 基体辅助激光解吸/离子化质谱
• 1.4.5.3 电喷雾质谱
• 1.4.6 核磁共振
• 1.4.7 荧光辅助糖电泳
• 1.4.8 其他分析技术
• 1.5 N-连接蛋白质糖基化分析展望
• 1.6 本论文涉及的N-连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究的概述
• 参考文献
• 第一篇 蛋白质糖基化分析微流控芯片平台和方法的研究
• 第二章 芯片电泳对简单糖的分离与检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.1.1 试剂
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 糖的AMAC 标记反应
• 2.2.3 糖的芯片电泳分离与检测
• 2.2.3.1 糖的芯片电泳/直接荧光检测
• 2.2.3.2 糖的芯片电泳/间接荧光检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 单糖的芯片电泳/直接检测
• 2.3.2 单糖的芯片电泳/间接荧光检测
• 2.3.2.1 缓冲液的选择
• 2.3.2.2 葡萄糖定量分析
• 2.3.2.3 简单糖的分离
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 芯片电泳/外切糖苷酶酶解对糖肽的分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.1.1 试剂
• 3.2.1.2 仪器
• 3.2.2 卵白蛋白的胰蛋白酶水解
• 3.2.3 卵白蛋白的链霉蛋白酶水解
• 3.2.4 外切糖苷酶水解
• 3.2.5 蛋白酶水解产物的荧光标记
• 3.2.6 芯片电泳
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 卵白蛋白胰蛋白酶水解产物的芯片电泳分离
• 3.3.2 鸡卵白蛋白的糖肽的分离
• 3.3.3 鸡卵白蛋白和火鸡卵白蛋白糖肽的分析
• 3.3.3.1 鸡卵白蛋白糖肽的分析
• 3.3.2.2 火鸡卵白蛋白的糖肽分析
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 集成化凝集素亲和芯片的构建及其对糖形的分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.1.1 试剂
• 4.2.1.2 仪器
• 4.2.2 豌豆凝集素亲和柱的制备
• 4.2.3 糖蛋白的荧光标记与纯化
• 4.2.4 凝集素亲和芯片
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 整体柱材料的制备
• 4.3.2 缓冲液体系
• 4.3.3 芯片特性的测定
• 4.3.4 豌豆凝集素亲和柱的非特异性吸附
• 4.3.5 豌豆凝集素亲和芯片的重现性及其对糖形的分离
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第二篇 蛋白质糖基化分析微流控芯片/质谱平台和方法的研究
• 第五章 微流控芯片/质谱接口的构建及其在糖基化分析中的应用
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.1.1 试剂
• 5.2.1.2 仪器
• 5.2.2 芯片通道和毛细管的修饰
• 5.2.3 芯片与质谱的连接
• 5.2.4 芯片电泳/质谱
• 5.2.5 RNase B 的胰蛋白酶酶解
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 鞘流液流速的优化
• 5.3.2 检测限
• 5.3.3 芯片电泳/质谱对肽的分析
• 5.3.4 芯片电泳/质谱对糖蛋白与糖肽的分析
• 5.4 结论
• 参考文献
• 第六章 基体辅助激光解吸离子化质谱对糖链结构的分析
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 仪器与试剂
• 6.2.1.1 试剂
• 6.2.1.2 仪器
• 6.2.2 糖链的释放
• 6.2.3 糖链的外切糖苷酶酶解
• 6.2.4 糖链的MALDI-TOF-MS 和MALDI-Q-TOF-MS 检测
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 MALDI-TOF-MS 和外切糖苷酶对糖链组成的分析
• 6.3.2 MALDI-Q-TOF-MS 对糖链结构的分析
• 6.4 结论
• 参考文献
• 总结论
• 作者简介
• 论文发表情况
• 博士期间申请专利情况
• 致谢