N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的克隆表达及其相关应用研究

论文摘要

大量的研究表明,核苷类似物有抗病毒和抗肿瘤活性。近年来,对于这一方面的研究已逐渐成为热点之一。N-脱氧核糖转移酶催化合成和转化核苷只有一步反应,而之前报道的用核苷磷酸化酶催化核苷的转化则必须有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶共同作用才能完成。所以本研究通过构造一个含有N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的工程菌,达到转化核苷的目的。用设计好的引物,将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的基因PCR扩增出来,然后将其连接到克隆载体pMD18-T上,通过测序鉴定并且BLAST比对正确之后,将N-脱氧核糖转移酶Ⅱ基因从克隆载体上酶切下来,连接到表达载体pET-28a上,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,构建得到一株连接有N-脱氧核糖转移酶Ⅱ基因的原核工程菌。对所得到的工程菌进行诱导表达,比较不同温度、诱导时间和IPTG浓度下的蛋白表达量,确定最佳的表达条件。最后在37℃温度诱导4h, IPTG浓度为0.1mmol/L时,工程菌可表达大量的目的蛋白,并且以可溶性胞内表达的蛋白为主。以诱导后的菌体破碎上清液为酶源,经酶活测定发现,工程菌是野生的瑞士乳杆菌中N-脱氧核糖转移酶Ⅱ活力的22倍。分别研究不同温度、反应时间、pH、底物浓度等条件下脱氧胞苷和脱氧腺苷合成反应的最佳条件,最终得到脱氧胞苷合成的最佳条件是：5mmol/L的底物浓度,在pH为7.1的Tris-HCl缓冲液条件下,加入200μL酶,60℃反应2h,最高转化率为59.19%。脱氧腺苷合成的最佳条件为：5mmol/L的底物浓度,在pH为7.1的Tris-HCl缓冲液条件下,加入200μL酶,60℃反应9h,最高转化率为82.01%。除此之外,研究发现一些过渡金属离子对反应有抑制作用。研究合成抗肿瘤药物5-氮杂胞苷的条件后,得到最佳的合成条件是：2mmol/L的底物浓度,在pH为7.1的Tris-HC1缓冲液条件下,加入200μL酶,60℃反应2h,最高转化率为61%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 核苷类化合物的简介
• 1.2 核苷类化合物的作用机理
• 1.3 常见的核苷类药物
• 1.3.1 具有抗病毒作用的核苷类药物
• 1.3.2 具有抗肿瘤作用的核苷类药物
• 1.4 核苷衍生物的传统化学合成法
• 1.4.1 糖基改造
• 1.4.2 碱基改造
• 1.5 核苷类药物的生物转化法—酶合成法
• 1.5.1 核苷磷酸化酶
• 1.5.2 N-脱氧核糖转移酶
• 1.6 N-脱氧核糖转移酶简介
• 1.6.1 N-脱氧核糖转移酶性质
• 1.6.2 N-脱氧核糖转移酶催化机理
• 1.6.3 N-脱氧核糖转移酶在核苷类似物合成方面的应用
• 1.7 研究意义及流程
• 第2章 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的克隆表达
• 2.1 材料方法
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.1.1 化学药品
• 2.1.1.2 生物制剂
• 2.1.1.3 培养基材料和配方
• 2.1.1.4 克隆用缓冲液
• 2.1.1.5 质粒和菌种
• 2.1.1.6 实验仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 大肠杆菌的培养
• 2.1.2.2 菌种保藏
• 2.1.2.3 大肠杆菌基因组提取
• 2.1.2.4 DNA的琼脂糖电泳
• 2.1.2.5 凝胶回收试剂盒回收凝胶
• 2.1.2.6 高效感受态细胞制备试剂盒制备感受态细胞
• 2.1.2.7 大肠杆菌的转化
• 2.1.2.8 碱裂解法制备质粒
• 2.1.2.9 DNA的酶切
• 2.1.2.10 DNA的连接
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 PCR扩增
• 2.2.2 克隆载体的构建
• 2.2.3 表达载体的构建
• 2.3 小结
• 第3章 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的诱导表达与活性分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要试剂与仪器
• 3.1.1.1 化学试剂
• 3.1.1.2 缓冲液
• 3.1.1.3 SDS-PAGE所用试剂
• 3.1.1.4 凝胶的配制
• 3.1.1.5 主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 N-脱氧核糖转移酶的诱导表达
• 3.2.2 IPTG浓度对蛋白表达的影响
• 3.2.3 诱导时间和温度对蛋白表达的影响
• 3.2.4 蛋白浓度的测定
• 3.2.5 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ活力的测定
• 3.2.6 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的酶学性质研究
• 3.2.6.1 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的温度稳定性研究
• 3.2.6.2 温度对N-脱氧核糖转移酶Ⅱ相对活力的影响
• 3.2.6.3 pH对N-脱氧核糖转移酶Ⅱ相对活力的影响
• 3.3 小结
• 第4章 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.1.1 化学试剂
• 4.1.1.2 生物试剂
• 4.1.1.3 主要仪器
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.2 转化率的测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 温度对N-脱氧核糖转移酶Ⅱ转化率的影响
• 4.2.2 pH对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.2.3 反应时间对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.2.4 底物浓度对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.2.5 酶蛋白质量对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.2.6 底物浓度比对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.2.7 离子对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.2.8 不同酶源对脱氧胞苷和脱氧腺苷转化率的影响
• 4.3 小结
• 第5章 用N-脱氧核糖转移酶Ⅱ合成5-氮杂脱氧胞苷
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 主要试剂与仪器
• 5.1.1.1 化学试剂
• 5.1.1.2 反应缓冲液
• 5.1.1.3 主要仪器
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 不同反应条件对5-氮杂胞苷转化率的影响
• 5.1.2.2 5-氮杂脱氧胞苷转化率的测定方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 pH对5-氮杂脱氧胞苷转化率的影响
• 5.2.2 反应时间对5-氮杂脱氧胞苷转化率的影响
• 5.2.3 底物浓度对5-氮杂脱氧胞苷转化率的影响
• 5.2.4 蛋白浓度对5-氮杂脱氧胞苷转化率的影响
• 5.2.5 离子对5-氮杂脱氧胞苷转化率的影响
• 5.3 小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢