兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和成骨诱导

论文摘要

目的:本实验从骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）体外扩增培养,观察MSCs的形态,检测不同因素对MSCs生长的影响,测定生长曲线。并体外诱导MSCs向成骨细胞方向分化,检测成骨特有的骨钙素及Ⅰ型胶原的表达,从而了解MSCs的生物学形状,探索MSCs的生长条件。 方法:抽取兔髂骨骨髓,利用Percoll分离液（1.073g/ml）进行密度梯度离心法从骨髓中分离骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,观察其形态学变化,测定MSC的生长动力学及对MSC生长的影响因素的分析,了解MSCs的生物学性状,研究MSCs的体外生长规律。 同时体外分离诱导培养MSCs向成骨细胞分化(培养液中加入地塞米松终浓度为10-8mol/L-、β—甘油磷酸钠为10mmol/L、维生素C为50μg/mL),通过检测碱性磷酸酶表达,Ⅰ型胶原分泌,骨钙素生成对其体外诱导成骨能力进行定性检测和观察,研究细胞生物学特性及其体外成骨能力。 结果:1、分离获取了较高纯度的MSCs,保持了细胞的活性。Percoll分离液（1.073g/ml）分离的骨髓单个核细胞24小时后贴壁,细胞呈圆形,48—72小时后呈纺锤形,梭形,增值迅速,原代培养月10—14天左右可以达到80—90%融合,传代细胞24小时完全贴壁,5—7天达到80—90%融合,可传代至10代以上,经传代后细胞增值能力有所下降,MSCs细胞逐渐出现衰老现象。细胞老化的表现为:细胞生长速度缓慢。细胞胞浆中出现多量空泡及颗粒样物质,细胞碎片的增多。在该培养条件下,原代

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 主要英文缩略语
• 前言
• 材料和方法
• 一、材料与试剂
• 1、试验动物
• 2、主要试剂
• 3、主要仪器、器皿
• 4、培养液和试剂的配制
• 二、实验方法
• （一） 兔骨髓间充质干细胞的分离和培养
• 1.兔MSC的原代培养
• 1.1 主要试剂与器械
• 1.2 步骤
• 2. 细胞传代
• 3. 细胞的冻存和复苏
• 3.1 细胞冻存
• 3.2 细胞复苏
• 4. HE染色固定细胞、组织观察
• （二） 细胞生长的测定
• 1、细胞计数
• 2、细胞生长指数的测定
• （三） 影响兔MSCs体外生长的因素
• 1、不同浓度FBS对MSCs生长的影响
• 2、不同种植密度对MSCs生长的影响
• 3、IGF对MSC细胞增值和细胞总蛋白含量的影响
• 4、统计学方法
• （四） 兔MSCs向成骨细胞的诱导分化和鉴定
• 结果
• 1. 兔骨髓间充质干细胞形态观察
• 1.1 原代培养
• 1.2 MSC的传代增殖
• 1.3 经诱导的MSCs
• 2. MSC的生长曲线
• 3. 影响兔MSCs体外生长的因素
• 3.1 不同浓度FBS对MSCs生长的影响
• 3.2 不同种植密度对MSCs生长的影响
• 3.3 IGF对三种细胞增值的影响
• 4. MSCs免疫细胞化学染色
• 讨论
• 一、MSCs的分离纯化方法
• 二、MSCs的体外扩增培养的形态学
• 三、MSCs的体外生长动力学
• 四、MSCs的体外培养的影响因素
• 五、MSCs表面标记
• 六、MSCs的多向分化潜能
• 七、MSC的诱导分化
• 1. 碱性成纤维细胞生长因子bFGF
• 2. 骨形态发生蛋白BMP
• 3. 转化生长因子TGF-β
• 4. Dex
• 八、MSC的成骨作用
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表论文
• 学位论文评阅及答辨情况表