免疫淀粉微球的制备及其在氯霉素检测中的应用

论文摘要

免疫淀粉微球是免疫学和变性淀粉技术结合而发展起来的一类新型材料。免疫淀粉微球是交联有抗体的淀粉微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物。通过离心，这种复合物可被滞留，与其它组分相分离。免疫亲和分离简便易行，分离纯度高，保留靶物质活性，且高效、快速、低毒，可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作靶向释药的载体等领域。本文以可溶性淀粉为原料，环氧氯丙烷为交联剂，Span60为表面活性剂，通过反相悬浮法合成淀粉微球。制备氯霉素抗原免疫小鼠，得到鼠抗氯霉素抗体。再利用环氧氯丙烷的活化淀粉微球，在微球表面交联上氯霉素抗体，合成免疫淀粉微球，并对免疫淀粉微球的抗体交联率进行了研究。探讨了工艺条件改变对免疫淀粉微球交联率的影响规律。以免疫淀粉微球为固定相，采用间接法检测抗体交联情况，采用倒置荧光显微镜观察。以交联率为考察指标，通过优化实验得到了此反应的最佳合成条件。同时讨论了反应时交联率与淀粉微球粒径和抗体浓度的匹配关系。采用标准加入法测定交联有氯霉素抗体的免疫淀粉微球分离氯霉素，紫外分光光度法检测分离的氯霉素。研究表明，淀粉微球的环氧活化度随活化剂环氧氯丙烷用量的增大先增大然后基本保持不变。当环氧氯丙烷用量为0.4mL/g时，所制备的淀粉微球的活化度达到最大值。淀粉微球的环氧活化度随振荡反应速率的增加先增加，达到一定值后不再有明显变化，当振荡速率在200r/min时活化度达到恒定值。免疫淀粉微球的交联率随温育时间的增大先增大而后基本保持不变，当温育时间在1小时后，免疫淀粉微球的交联率基本不再变化。免疫淀粉微球的交联率4℃反应时间的增加先是增大，增大幅度有限，在时间达到9小时之后，交联率达到60%左右，之后交联率不再上升。免疫淀粉微球的交联率在pH值为8时，所合成的免疫淀粉微球的交联率最大。荧光倒置显微镜观察免疫淀粉微球表面呈现绿色荧光，说明在碱性条件下，交联剂环氧氯丙烷首先与淀粉微球上羟基通过氯取代连接，而环氧基团进一步与抗体的氨基发生了交联反应，得到了粒径均匀，表面交联有抗体的免疫淀粉微球。利用交联有氯霉素抗体的免疫淀粉微球能够有效分离溶液中的氯霉素，回收率为83.92%~90.8%，分离氯霉素的浓缩倍数21.25~22.7倍，采用紫外分光光度法检测灵敏度达到0.1μg/mL，是一种操作简单，成本低廉，灵敏度高，具有推广价值的氯霉素分离检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 前言
• 1.1 免疫微球的分类
• 1.1.1 按微球的制备原料分类
• 1.1.2 按淀粉微球的合成方法分类
• 1.1.2.1 研磨法
• 1.1.2.2 共沉淀法
• 1.1.2.3 反相悬浮法
• 1.1.3 按微球的活化方法分类
• 1.2 氯霉素的分离检测方法
• 1.2.1 微生物学法
• 1.2.2 高效液相色谱法
• 1.2.3 气相色谱法
• 1.2.4 色谱-质谱联用法
• 1.2.5 免疫分析方法
• 1.3 免疫淀粉微球的性质
• 1.4 免疫淀粉微球的合成方法
• 1.4.1 淀粉微球的合成方法
• 1.4.2 抗体的产生机理
• 1.4.3 免疫淀粉微球的合成方法
• 1.5 免疫淀粉微球的制备
• 1.5.1 淀粉微球的制备
• 1.5.2 抗体的制备
• 1.5.3 免疫微球的制备
• 1.6 免疫微球的作用及用途
• 1.6.1 免疫微球的作用
• 1.6.1.1 形成良好的分离状态
• 1.6.1.2 免疫亲和
• 1.6.1.3 实现靶向
• 1.6.2 免疫微球的用途
• 1.6.2.1 分离和提纯靶分子
• 1.6.2.2 免疫检测
• 1.6.2.3 体外扩增
• 1.6.2.4 肿瘤的治疗
• 1.6.2.5 其他用途
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验原理
• 2.2 实验药品和仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 准免疫淀粉微球的制备
• 2.3.2 抗氯霉素（CAP）抗体的制备
• 2.3.2.1 重氮化法合成免疫原
• 2.3.2.2 免疫注射小鼠
• 2.3.2.3 抗体效价的测定
• 2.3.2.4 抗体纯化
• 2.3.2.5 抗体的浓度纯度测定
• 2.3.3 准免疫淀粉微球与抗体的交联反应
• 2.3.4 FITC 标记二抗检测淀粉微球与抗体的交联效果
• 2.3.5 倒置荧光显微镜观测
• 2.4 淀粉微球环氧活化度影响因素的分析
• 2.4.1 环氧氯丙烷用量对淀粉微球活化度的影响
• 2.4.2 振荡速度对淀粉微球活化度的影响
• 2.5 免疫淀粉微球抗体交联率影响的因素分析
• 2.5.1 温育反应时间对免疫淀粉微球抗体交联率的影响
• 2.5.2 温育反应温度对免疫淀粉微球抗体交联率的影响
• 2.5.3 pH 值对免疫淀粉微球抗体交联率的影响
• 2.6 不同粒径的淀粉微球与抗体的交联量分析
• 2.6.1 不同粒径淀粉微球的制备
• 2.6.2 不同粒径淀粉微球的抗体交联反应
• 2.6.3 抗体交联量的计算
• 2.7 免疫淀粉微球分离和富集氯霉素的应用研究
• 2.7.1 氯霉素标准曲线的制作
• 2.7.2 紫外分光光度法检测氯霉素的灵敏度测试
• 2.7.3 免疫淀粉微球对含氯霉素污水的处理
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 准免疫淀粉微球的表观形态
• 3.2 氯霉素抗体的制备结果
• 3.2.1 氯霉素-BSA（牛血清白蛋白）抗原电泳图
• 3.2.2 氯霉素抗体的效价
• 3.2.3 氯霉素抗体浓度和纯度
• 3.3 影响淀粉微球环氧活化度的因素
• 3.3.1 环氧氯丙烷的用量对淀粉微球活化度的影响
• 3.3.2 振荡速率对淀粉微球活化度的影响
• 3.4 影响免疫淀粉微球抗体交联率的因素
• 3.4.1 温育反应时间对免疫淀粉微球交联率的影响
• 3.4.2 反应温度对免疫淀粉微球交联率的影响
• 3.4.3 反应 pH 值对免疫淀粉微球抗体交联率的影响
• 3.5 不同粒径淀粉微球抗体的交联量
• 3.6 免疫淀粉微球的表观形态
• 3.7 免疫淀粉微球的应用研究
• 3.7.1 免疫淀粉微球分离污水中氯霉素的回收率
• 3.7.2 免疫淀粉微球对氯霉素浓缩倍数
• 3.7.3 紫外分光光度法检测氯霉素的灵敏度
• 结论
• 参考文献
• 致谢