论文摘要
志贺氏菌属（Shigella）细菌，是人类及灵长类动物细菌性痢疾（简称菌痢）的致病菌，是急性感染性腹泻的主要病原体之一，主要流行于发展中国家，但发达国家也时有爆发。由于大量抗生素的不断使用，导致志贺氏菌属细菌的耐药性逐年增加，使治疗难度有增大的趋势。主动外排机制在细菌多耐药性产生机制中发挥着主要作用。目前研究已证实了志贺氏菌中存在着多种耐药外排泵蛋白。为了解志贺氏菌属细菌的多重耐药泵emrE的功能及其进化，本研究采用琼脂二倍稀释法测定抗生素对临床收集的志贺氏菌最低抑菌浓度，发现这10株多耐药志贺氏菌株的耐药谱有一定差异，从中筛选出临床多耐药株H24，并对其进行血清学鉴定，证实多耐药株H24为宋内氏志贺氏菌。利用PCR技术从宋内氏志贺氏菌多耐药株H24总DNA中克隆到包含自身启动子的DNA片段。将该片段插入到原核克隆载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α，对重组质粒进行酶切鉴定，证实重组菌株构建成功。对emrE基因进行测序，在此基础上进行同源性比较并构建进化树。测序结果表明该片段与Genbank中的宋内氏志贺氏菌株S．sonnei Ss046的emrE基因碱基序列完全一致，进化树分析显示emrE基因在不同细菌的基因组间无水平转移的迹象。采用琼脂二倍稀释法检测重组菌株在加入泵抑制剂氰氯苯腙（CCCP）前后对七种抗生素的最低抑菌浓度（MIC值）的变化情况。结果发现相对于未携带emrE的对照菌株pMD（DH5α），重组菌株pMD-emrE（DH5α）对四环素和红霉素的MIC值分别提高了1倍和2倍，而对其它抗生素却无明显效果。加入泵抑制剂CCCP后重组菌株及对照株的耐药程度则无明显差异。证明emrE介导的四环素和红霉素的耐药与质子外排泵相关。提取重组菌株及对照株的菌体总RNA，以大肠杆菌内稳定表达的看家基因gapA内部的380bp片段作为内参，gapA基因编码大肠杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，RT-PCR检测主动外排基因emrE在重组株和对照株中的表达水平。结果发现pMD-emrE（DH5α）重组菌emrE基因的表达水平比pMD（DH5α）空白对照株有显著提高。本研究结果表明：志贺氏菌多耐药株emrE基因介导对四环素和红霉素的抗性，这种能力可能与编码区基因的突变无关，而与emrE基因编码蛋白的表达量升高有关。通过对emrE基因的同源分析并没有发现明显的细菌基因组间的水平转移现象。