对映归一性环氧水解酶的克隆与表征

论文摘要

绿豆环氧水解酶能对映归一性水解消旋环氧化物生成单一构型的二醇,在手性合成领域具有重要的应用前景。绿豆中至少存在两种选择性不同环氧水解酶（mbEH A和mbEH B）,本课题组已获得mbEH A （VrEH1）的编码基因vrehl,并对重组酶mbEH A进行了表征。本论文成功地克隆了另两个环氧水解酶基因vreh2和vrehg。vreh2的开放阅读框（ORF）含957 bp,编码318个氨基酸和一个终止子,编码产物与大豆环氧水解酶（Glycine max, XP003554634.1,87%）和苜蓿环氧水解酶（Medicago truncatula, XP003626245.1,86%）高度同源,但与VrEH1（ADP68585.1）和土豆环氧水解酶(Solanum tuberosum, AAA81892.1的同源性仅有72%和57%。vrehg与vrehl高度相似,均编码319个氨基酸,基因水平同源性为99%,蛋白水平同源度为98%。成功构建了vreh2和vrehg的表达载体并在大肠杆菌BL21（DE3）进行了表达,IPTG浓度为0.1mM条件下,15℃诱导16小时,VrEH2和VrEHg表达量占菌体总蛋白的25-35%,且主要以不溶的包涵体表达为主。降低诱导剂IPTG浓度、改变菌体破碎用缓冲液pH、更换含可溶性标签的载体和／或表达菌株均不能明显改变vreh2不溶性包涵体表达的状态。Ni-亲和层析一步纯化了重组VrEH2,纯化倍数为925,酶活回收效率为40%。重组VrEH1和VrEH2的最适pH和最适反应温度分别为7.7,45℃和6.5,30℃。VrEH2对表面活性剂和金属离子不敏感。10%异辛烷对重组VrEH2酶活力没有大的影响,并能明显提高产物的对映体过量值（eep=89%）。VrEH1优先水解（S）-pNSO,其KM, S, KM, R和kcat,S,kcat,R分别为5.5,1.4 mM和6.2,0.42s-1；相对应,VrEH2优先水解（R）-pNSO,其KM, S, KM, R和kcat, S, kcat, R分别为1.44,0.019 mM和0.13,1.76 s-1。VrEH1和VrEH2均优先进攻pNSO的a碳原子,VrEH1的选择性系数为α（R）/β（R） =13/87, α（S）/β（S）=83/17;VrEH2的选择性系数为α（R）/β（R）=7/93, α（S）/β（S）=72/28。VrEH1和VrEH2对多种含苯环的环氧底物（BGE, PGE等）有活性,活力均比对pNSO高。除VrEH2对3M-PGE有对映会聚性外,VrEH1和VrEH2对其他底物均表现为对映选择性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 手性环氧化物及其产物邻二醇
• 1.1.1 手性环氧化物简介
• 1.1.2 手性环氧化物及邻位二醇的合成
• 1.1.2.1 化学法
• 1.1.2.2 生物法
• 1.2 环氧水解酶
• 1.2.1 环氧水解酶的结构特点与催化机制
• 1.2.2 立体选择性
• 1.2.3 环氧水解酶的应用研究进展
• 1.2.3.1 环氧水解酶作为抑制剂靶点
• 1.2.3.2 环氧水解酶作为生物催化剂
• 1.2.3.3 环氧水解酶在两水相体系中的应用
• 1.2.3.4 环氧水解酶的改造
• 1.3 本课题目的与意义
• 第2章 环氧水解酶基因的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 材料与试剂
• 2.2.1.2 实验仪器
• 2.2.1.3 质粒与菌株
• 2.2.1.4 引物设计
• 2.2.1.5 微生物培养基和药品配制
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 改良Trizol法抽提RNA
• 2.2.2.2 反转录获取CDNA
• 2.2.2.3 RACE反应
• 2.2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2.6 PCR产物纯化
• 2.2.2.7 连接和转化
• 2.2.2.8 克隆测定与测序
• 2.2.2.9 菌种保藏
• 2.2.2.10 全长序列的获取
• 2.2.2.11 vreh2序列分析
• 2.2.2.12 三维结构及活性中心预测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 RNA提取结果
• 2.3.2 RACE结果
• 2.3.3 环氧水解酶全长序列的获得
• 2.3.4 序列分析结果
• 2.3.5 三维结构及活性中心预测
• 2.4 本章小结
• 第3章 环氧水解酶的重组表达与优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验器材
• 3.2.2 药品的配制
• 3.2.3 培养基与菌株和载体
• 3.2.4 引物设计
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 重组菌的构建
• 3.3.2 环氧水解酶的初步表达
• 3.3.3 环氧水解酶表达条件的优化
• 3.3.3.1 不同浓度IPTG对蛋白表达的影响
• 3.3.3.2 不同破碎液pH对可溶性的影响
• 3.3.3.3 不同载体和宿主对可溶性表达的影响
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 重组表达质粒的构建
• 3.4.2 重组环氧水解酶的初步表达
• 3.4.3 环氧水解酶VrEH2的表达优化
• 3.4.3.1 不同IPTG浓度对可溶性表达的影响
• 3.4.3.2 不同载体和宿主对可溶性表达的影响
• 3.4.3.3 不同pH值破碎液对蛋白可溶性的影响
• 3.5 本章小结
• 第4章 环氧水解酶的酶学性质表征
• 4.1 引言
• 4.2 实验仪器与材料
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 溶液和药品的配制
• 4.2.2.1 流动相配制
• 4.2.2.2 缓冲液配制
• 4.2.2.3 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 底物pNSO的合成及消旋底物的拆分
• 4.3.2 环氧水解酶酶活的测定与蛋白纯化
• 4.3.2.1 酶活测定方法的建立
• 4.3.2.2 蛋白纯化
• 4.3.2.3 蛋白浓度测定
• 4.3.2.4 酶活测定
• 4.3.3 不同pH对酶活性的影响
• 4.3.4 不同温度对酶活性的影响
• 4.3.5 不同化学试剂对酶的活性影响
• 4.3.6 有机溶剂对酶活力的影响
• 4.3.7 动力学常数的测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 pNSO的合成及色谱法拆分
• 4.4.2 蛋白纯化
• 4.4.3 酶活测定
• 4.4.4 不同pH缓冲液对酶活性的影响
• 4.4.5 不同温度对酶活性的影响及温度稳定性
• 4.4.6 不同化学试剂对酶活性的影响
• 4.4.7 有机溶剂对环氧水解酶活力的影响
• 4.4.8 酶的动力学常数
• 4.5 本章小结
• 第5章 环氧水解酶的位置选择性和底物谱
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 底物
• 5.2.2 材料
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 VrEH1和VrEH2对pNSO的立体选择性
• 5.3.2 VrEH2底物谱
• 5.3.2.1 标准曲线的建立
• 5.3.2.2 VrEH对各种底物的活力和对映归一性
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 重组环氧水解VrEH1和VrEH2立体选择性差异
• 5.4.2 标准曲线的建立
• 5.4.3 VrEH2对各种底物的活力和对映归一性
• 5.5 本章小结
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢