人源性抗bFGF单链抗体及双价抗体在毕赤酵母中的表达、纯化及鉴定

论文摘要

目的：为了提高人源性抗bFGF抗体的表达量，构建抗bFGF单链抗体ScFv、双价抗体Diabody的酵母表达载体，利用毕赤酵母表达系统表达人源性的抗bFGF ScFv及Diabody并研究其生物学活性。方法：从噬菌体抗体库筛选出的人源性抗bFGF抗体基因中亚克隆单链抗体ScFv基因；以抗bFGF单链抗体为模板，设计引物通过PCR的方法分别扩增出VH、VL，并通过重叠PCR引入中间连接肽（G4S）将其连接构建Diabody基因；将测序正确的ScFv、Diabody基因分别克隆入酵母表达载体pPICZαA中，构建酵母表达工程菌，SDS-PAGE和Western Blot鉴定其表达，间接ELISA检验其特异性；经镍离子亲和层析、阴离子交换层析两步法纯化目的蛋白，将纯化的抗bFGF ScFv及Diabody抗体作用于人肺腺癌细胞株A549，CCK8法检测其增值抑制率。Hoechst33258荧光染色及流式细胞术检验Diabody诱导A549的凋亡。结果：成功构建人源性抗bFGF ScFv及Diabody酵母表达载体，获得3株高表达ScFv及2株高表达Diabody的酵母工程菌，经1%甲醇诱导约48h表达量即可恒定，SDS-PAGE及Western Blot检测结果显示目的蛋白约36kDa、34kDa，经两步纯化抗体的纯度可达90%以上，间接ELISA检验目的蛋白均可与bFGF特异性结合，Diabody的亲和力要优于ScFv，均可抑制人肺腺癌细胞株A549的增殖，并呈剂量依赖性。Hoechst33258荧光染色及流式细胞术结果显示Diabody能够诱导A549的凋亡。结论：bFGF作为关键的促血管生成因子，与肿瘤的发生、发展密切相关，通过构建并表达了抗bFGF单链抗体ScFv、双价抗体Diabody，体外研究表明其均可抑制人肺腺癌细胞株A549的增殖，并呈剂量依赖性，并且Diabody能够诱导A549的凋亡，从而为进一步研究抗bFGF抗体的生物学特性、结构与功能的关系等奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一部分 前言
• 1.1 bFGF 与血管再生
• 1.2 bFGF 与肺癌
• 1.3 小分子抗体及其在肿瘤诊治方面的应用
• 1.4 毕赤酵母表达系统及其在基因工程抗体中的应用
• 1.5 研究目的及意义
• 1.6 实验技术路线
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 载体和菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要试剂配制方法
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗 bFGF ScFv 基因的扩增及克隆载体的构建
• 2.2.2 抗 bFGF Diabody 基因的构建及克隆载体的构建
• 2.2.3 ScFv、Diabody 酵母表达载体的构建
• 2.2.4 pPICZαA–ScFv/Diabody 转化毕赤酵母 GS115 及酵母工程菌的筛选
• 2.2.5 ScFv、Diabody 酵母工程菌的诱导表达及鉴定
• 2.2.6 ScFv、Diabody 酵母工程菌的摇瓶发酵及纯化
• 2.2.7 CCK-8 法检测人肺腺癌细胞株 A549 细胞增殖抑制作用
• 2.2.8 Hoechst 33258 染色观察人肺腺癌细胞株 A549 的凋亡
• 2.2.9 Annexin V-FITC/PI 检测 Diabody 诱导人肺腺癌细胞株 A549 的凋亡
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 抗 bFGF ScFv 基因的克隆及表达载体构建
• 3.2 抗 bFGF Diabody 基因的克隆及表达载体构建
• 3.3 pPICZαA–ScFv 转化毕赤酵母 GS115 及酵母工程菌的筛选
• 3.3.1 pPICZαA–ScFv、pPICZαA-Diabody 线性化质粒的制备
• 3.3.2 高拷贝转化子筛选
• 3.4 重组酵母的表达及鉴定
• 3.5 最佳诱导表达时间的确定
• 3.6 表达产物的纯化
• 3.6.1 表达产物的纯化及 SDS-PAGE 鉴定
• 3.6.2 目的蛋白浓度测定
• 3.6.3 间接 ELISA 检测
• 3.7 肿瘤细胞增殖抑制试验
• 3.8 Hoechst 33258 染色观察人肺腺癌细胞株 A549 的凋亡
• 3.9 Annexin V-FITC/PI 检测 Diabody 诱导人肺腺癌细胞株 A549 的凋亡
• 第四部分 讨论
• 总结
• 参考文献
• 中英文略语表
• 附录
• 1 在校期间发表论文及申请专利情况
• 2 在校期间参加的学术活动
• 致谢