S-腺苷-L-甲硫氨酸分离纯化工艺研究

论文摘要

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是生物体内重要的小分子,在治疗肝病和抑郁症方面有着很好的疗效。而我国作为一个肝炎和抑郁症的多发性国家,有着广阔的市场需求。本文将高密度发酵技术应用于SAM的生产,5L发酵罐,添加40g前体L-蛋氨酸,发酵58小时,SAM产量可以达到10.0g·L-1以上,初步具备了工业化生产的条件。本文研究了两种不同的破碎酵母释放SAM的方法,乙酸乙酯法和热水抽提法。100g湿菌体用体积浓度为50%乙酸乙酯50ml,萃取40min,然后加入100ml浓度为0.4mol/L的硫酸萃取80min,总回收率可以达到92.0%左右。温度70℃、每30g湿菌体加入热水100ml、硫酸浓度0.25mol/L搅拌转速160r/min, SAM的抽提率可达91.5%。筛选了一种效果较好的弱酸性阳离子交换树脂南开110,并研究了其静态吸附动力学和吸附平衡曲线,得出南开110对SAM吸附符合离子交换平衡模型的Langmuir吸附。通过研究发现,南开110对SAM静态吸附的最佳pH=5.0,吸附量可达162.6mg/g,静态解吸的硫酸浓度为0.5mol/L,解吸率可达97.4%。通过对不同浓度下静态吸附的研究得出了静态吸附的最佳浓度在5-8g/L之间。对影响SAM在南开110弱酸阳离子交换树脂上动态吸附的流速、pH、初始浓度、床高等,进行了考察,得出对于内径（?）=1.3cm的固定床吸附最佳流速为0.6ml/min、最佳pH=5.0、最佳初始浓度为5-8g/L之间,比较好的固定床的高径比约为7.5：1。尝试了按等设备负荷和等高径比的原则进行放大,放大固定床吸附柱的内径（?）=5cm,其吸附收率可达86%、洗脱收率约为87%。采用了分布洗脱和丙酮沉淀的方法,制得了纯度为95%（HPLC）的SAM硫酸盐,制备硫酸盐的总收率为58.3%。采用了文献报道得硫酸盐中添加质量浓度为30%的对甲苯磺酸的方法,制备了SAM的硫酸对甲苯磺酸双盐,其纯度为97.0%（HPLC）,收率81.2%,制备双盐的总收率为47.4%。对自制的SAM硫酸盐进行了质谱分析,证明了制得的产品为SAM和硫酸的结合物,分子式为SAM+·HSO4-·H2SO4·1.54（H2O）。最后研究了聚天门冬氨酸-SAM盐的制备原理,以及影响制备的因素。制备条件为pH<2.5,乙醇的用量为3.5倍反应液体积,聚天门冬氨酸用量和SAM用量的摩尔比>3：1,制备收率可达到90%。聚天门冬氨酸-SAM盐水溶液溶液的稳定性,比SAM硫酸盐水溶液的稳定性提高了约11%。通过紫外可见全波段扫描、红外光谱、核磁共振氢谱的研究,得出聚天门冬氨酸和SAM确实是发生了反应,并不是简单的混合。制备过程中SAM的性质没有发生改变,仍然保持了其生物活性形式。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 S-腺苷-L-甲硫氨酸概述
• 1.2 SAM的理化性质
• 1.2.1 SAM的结构性质
• 1.2.2 SAM体内代谢途径及其稳定性
• 1.3 SAM的生物学功能和临床应用研究
• 1.4 SAM的生产方法
• 1.5 SAM提取工艺
• 1.6 S-腺苷-L-蛋氨酸的市场前景
• 1.7 小结
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 分光光度法测定细胞干重
• 2.2.2 S-腺苷-L-蛋氨酸的定量分析
• 2.2.3 蛋白质类物质的含量测定
• 2.2.4 其他
• 第三章 5升发酵罐高密度发酵生产腺苷蛋氨酸
• 3.1 菌种保藏
• 3.2 培养基
• 3.2.1 斜面培养基
• 3.2.2 种子培养基
• 3.2.3 摇瓶培养基
• 3.2.4 高密度发酵培养基
• 3.2.5 高密度发酵流加培养基
• 3.3 种子和高密度发酵培养
• 3.3.1 种子培养
• 3.3.1.1 斜面培养
• 3.3.1.2 种子培养
• 3.3.1.3 摇瓶培养
• 3.3.2 发酵罐高密度发酵培养
• 3.4 酿酒酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸
• 3.4.1 不同发酵批次监测数据的纵向比较
• 3.4.2 不同发酵批次的横向比较
• 3.5 小结
• 第四章 SAM的萃取方法研究
• 4.1 乙酸乙酯—硫酸法萃取SAM
• 4.1.1 乙酸乙酯浓度对萃取效果的影响
• 4.1.2 萃取时间对萃取率的影响
• 4.1.3 加入不同浓度的硫酸对萃取效果的影响
• 4.1.4 小结
• 4.2 热水抽提S-腺苷-L-甲硫氨酸
• 4.2.1 SAM热稳定性研究
• 4.2.2 SAM热抽提温度的选择
• 4.2.3 SAM热抽提时间的确定
• 4.2.4 SAM热抽提热水用量的确定
• 4.2.5 搅拌转速对热抽提SAM的影响
• 4.2.6 硫酸浓度对热抽提SAM的影响
• 4.2.7 小结
• 4.3 三种不同抽提方法的抽提效果比较
• 4.3.1 高氯酸法
• 4.3.2 三种不同抽提方法的对比
• 4.3.2.1 蛋白含量对比
• 4.3.2.2 全波段扫描杂质含量对比
• 4.4 小结
• 第五章 离子交换法分离纯化SAM
• 5.1 离子交换概述
• 5.2 SAM的离子交换树脂的筛选
• 5.3 南开110弱酸树脂的静态吸附和解吸研究
• 5.3.1 南开110树脂不同浓度下的吸附动力学曲线
• 5.3.2 南开110树脂不同浓度下的吸附平衡曲线
• 5.3.3 pH对静态吸附容量的影响
• 5.3.4 不同浓度硫酸的解吸效果
• 5.3.5 小结
• 5.4 SAM动态吸附解吸研究
• 5.4.1 动态吸附时待吸附液上样浓度的确定
• 5.4.2 动态吸附实验
• 5.4.2.1 流速对动态吸附容量的影响
• 5.4.2.2 pH对动态吸附容量的影响
• 5.4.2.3 上样浓度对动态吸附的影响
• 5.4.2.4 床体高度的影响
• 5.4.2.5 动态解吸研究
• 5.4.2.6 动态实验小结
• 5.5 有机溶剂沉淀法制备SAM硫酸盐
• 5.6 SAM硫酸对甲苯磺酸双盐的制备
• 5.7 树脂分离的放大实验
• 5.7.1 吸附放大实验
• 5.7.2 树脂柱的分步洗脱
• 5.7.2.1 去离子水清洗床体
• 5.7.2.2 稀酸洗脱杂质
• 5.7.2.3 浓酸解吸
• 5.8 产品质谱分析
• 5.9 小结
• 第六章 聚天门冬氨酸S-腺苷-L-甲硫氨酸的制备
• 6.1 聚天门冬氨酸SAM盐的制备初探
• 6.1.1 制备原理及制备方法
• 6.1.2 pH值对聚天门冬氨酸SAM盐制备的影响
• 6.1.3 聚天门冬氨酸用量对聚天门冬氨酸SAM盐制备的影响
• 6.1.4 乙醇用量对聚天门冬氨酸SAM盐制备的影响
• 6.1.5 聚天门冬氨酸SAM盐溶液稳定性研究
• 6.2 聚天门冬氨酸SAM盐的表征
• 6.2.1 可见—紫外吸收光谱扫描分析
• 6.2.2 HPLC分析
• 6.2.3 红外表征
• 6.2.4 NMR分析
• 6.3 小结
• 第七章 结论
• 第八章 问题与建议
• 8.1 存在的问题
• 8.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者简介
• 附件