细胞凋亡中Cyclin A-Cdk2底物的筛选及其功能研究

论文摘要

细胞凋亡,又称程序性细胞死亡,在维持多细胞生物发育和自稳平衡中发挥着重要作用。细胞凋亡的过盛和缺失皆可导致大量疾病的发生。因此,阐明细胞凋亡中信号转导机制,实现细胞凋亡的有效调控,成为了现代医学、药学界的核心研究目标。本论文研究发现,Cdk2酶活力在紫杉醇诱导HeLa细胞凋亡的过程中快速上调,而p21CIP1或无活性的点突变Cdk2（Cdk2-dn）的过表达能够有效抑制紫杉醇诱导HeLa细胞的凋亡,线粒体膜电位的去极化,Cytochrome c的释放以及Caspase-3的激活。这些结果表明,Cdk2可以通过调控线粒体膜电位的去极化和Cytochrome c的释放调控细胞凋亡。为了寻找Cyclin A-Cdk2在细胞凋亡中的特异性底物,我们克隆、表达、纯化了Bcl-2家族蛋白质: Bad,Bid,Bmf,BimS,Bik。通过体外激酶实验,我们发现Cyclin A-Cdk2只对促凋亡蛋白质Bad有磷酸化作用,而另外四种蛋白质则没有被Cyclin A-Cdk2磷酸化。在细胞内,我们也发现了Cyclin A-Cdk2对Bad蛋白质的磷酸化修饰。结合生物信息学分析,通过激酶实验证明了Cyclin A-Cdk2磷酸化Bad蛋白质的91位丝氨酸。在进一步功能研究中发现,Bad蛋白质91位丝氨酸的磷酸化介导了该蛋白质本身的促凋亡功能,表明Cyclin A-Cdk2对细胞凋亡的调控可能是通过对Bad蛋白质的磷酸化实现的。

论文目录

• 提要
• 第一篇 前言
• 第一章 背景知识
• 第一节 细胞凋亡概述
• 第二节 细胞凋亡通路及相关分子
• 第三节 Cyclin A-Cdk2 概述
• 第四节 紫杉醇的研究进展
• 第二章 论文的研究目的和设计思路
• 第一节 论文的研究目的
• 第二节 论文设计思路
• 第二篇 材料与方法
• 第一章 材料与试剂
• 一、菌株和细胞株
• 二、试剂和酶类
• 三、抗体
• 四、主要溶液
• 第二章 实验方法
• 一、细胞培养
• 二、全细胞裂解液的制备
• 三、线粒体及胞浆蛋白质的分离和制备
• 四、BCA法测定蛋白质浓度
• 五、体外Caspase活力测定
• 六、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE Assay）
• 七、免疫印迹分析
• 八、DNA转染
• 九、MitoCapture 染色测线粒体膜电位
• 十、质粒构建
• 十一、GST融合蛋白的表达和纯化
• 十二、体外磷酸化实验
• 十三、免疫共沉淀
• 第三篇 结果与讨论
• 第一章 Paclitaxel诱导HeLa细胞凋亡中Cdk2 的作用机制研究
• 第一节 Cyclin A-Cdk2 在 Paclitaxel 诱导 HeLa 细胞凋亡过程中的必要性
• 第二节 Cyclin A-Cdk2 调控线粒体膜通透性变化
• 第三节 小结
• 第二章 Cyclin A-Cdk2 细胞凋亡特异性底物的筛选
• 第一节 Bid、Bad、Bik、Bmf、BimS基因的克隆、表达及融合蛋白的纯化
• 第二节 对Bid、Bad、Bik、Bmf、BimS的体外激酶实验
• 第三节 小结
• 第三章 Cyclin A-Cdk2 磷酸化Bad调控细胞凋亡机制的研究
• 第一节 Cyclin A-Cdk2 磷酸化Bad第91 位丝氨酸
• 第二节 Bad蛋白质91 位丝氨酸的磷酸化增强其促凋亡活性
• 第三节 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语