禾谷丝核菌（Rhizoctonia Cerealis）对戊唑醇的抗性机制研究

论文摘要

本研究以野生敏感型禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)菌株(WW)为材料,经药剂筛选和UV诱导,分别获得了抗戊唑醇(Tebuconazole)禾谷丝核菌菌株(WX1、WX2和WWL)。戊唑醇对3个菌株的EC50值由0.0120μg/mL分别增加到0.1226μg/mL、0.2585μg/mL和0.4004μg/mL,抗性分别为10.2倍、21.5倍33.4倍。以获得的抗性菌株和敏感菌株为材料,采用菌落直径法和菌丝干重法研究了查彼克(Czapek)培养基中不同营养源、pH值和温度对抗性和敏感菌株生长的影响,以探明抗性菌株和敏感菌株之间生理适合度的差异。发现在不同碳源条件下,所有菌株都在蔗糖、甘油和葡萄糖中生长最快,在木糖和果糖中生长相对较慢;在相同碳源条件下,高抗菌株(WWL)的生长速度小于敏感菌株(WW)和中抗菌株(WX1和WX2),WX1、WX2和WW之间的生长速度差异不明显。在不同氮源条件下,所试菌株均能较好利用硝酸盐、亚硝酸盐、精氨酸和丙氨酸,不能充分利用胱氨酸;在同一氮源条件下,WWL的生长速度小于WW、WX1和WX2,而WX1、WX2和WW之间差异不明显。所有供试菌株在pH值6、7、11、12时生长均较快,在pH值为4和10时生长最慢;当pH值为4时,WWL的菌落直径要明显大于WX1、WX2和WW;当pH为5、11和12时,WWL的菌落直径要明显小于其它菌株,pH值为6、7、8、9和10时,各菌株间菌落直径差异不明显。所有菌株均是在20和25℃时生长速度最快,在10和30℃时生长最慢,基本不能生长。在相同的温度条件下,WWL的菌落直径要相对高于WX1、WX2和WW,但WX1、WX2和WW之间的菌落直径差异不明显。不同浓度戊唑醇处理抗性与敏感菌株后,体内过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性与抗药性呈一定的相关性。用戊唑醇处理所有菌株,24h内所有菌株的POD活性不断升高,抗性菌株的POD活性明显高于敏感菌株,其中WWL的活性最高;至24 h,用25 mg/L戊唑醇处理后WWL、WX2、WX1和WW的POD活性分别为44.16、30.64、20.56和17.44 u/g·min,均达最高值。PAL活性表现出先迅速上升又迅速下降的趋势,以25 mg/L处理1.5 h时WWL活性最高,达7020 u/g·h;WX2、WX1和WW的PAL活性值也分别为6375、5800和5370 u/g·h;此后所有处理的PAL活性随着时间迅速下降,至24h时达到最低值,各菌株活性大小排列依次为WWL>WX2>WX1>WW。酯酶同工酶和可溶性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,抗性菌株和敏感菌株无论在谱带数上还是量上都存在明显的差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 一、植物病原真菌对DMIs 杀菌剂的抗药性机制研究进展
• 1 DMIs 杀菌剂的作用机理
• 2 植物病原真菌对DMIs 杀菌剂的抗药性现状
• 3 植物病原真菌对DMIs 杀菌剂的抗药性机理
• 二、小麦纹枯病研究概述
• 1 分布及危害
• 2 症状
• 3 病原菌
• 4 发病规律及影响发病因素
• 5 小麦对纹枯病的抗性及抗性机理
• 6 综合防治
• 7 问题与展望
• 三、农用三唑类（Triazole）杀菌剂研究概述
• 1 发展简史及开发现状
• 2 作用机制
• 3 主要品种
• 4 农用三唑类杀菌剂的生物活性
• 5 存在的问题及展望
• 第二章 禾谷丝核菌抗戊唑醇突变体的诱导及其生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 毒力测定方法
• 1.3 R. cerealis 抗药突变体诱导方法
• 1.4 抗药突变体遗传稳定性测定
• 1.5 碳、氮营养源对抗药突变体生长的影响
• 1.6 PH 值对抗药突变体生长的影响
• 1.7 温度对抗药突变体生长的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性菌株的获得
• 2.2 抗药突变体的遗传稳定性
• 2.3 碳、氮营养源对抗药突变体生长的影响
• 2.4 PH 值对各抗药突变体生长的影响
• 2.5 温度对各抗药突变体生长的影响
• 3 讨论
• 第三章 抗、敏菌株体内POD 和PAL 活性及其体内酯酶同工酶和可溶性蛋白电泳图谱比较
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 抗性菌株和敏感菌株苯丙氨酸解氨酶活力测定
• 1.3 抗性菌株和敏感菌株过氧化物酶活力测定
• 1.4 抗性菌株和敏感菌株酯酶同工酶电泳
• 1.5 抗性菌株和敏感菌株可溶性蛋白质电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性菌株和敏感菌株苯丙氨酸解氨酶活力测定
• 2.2 抗性菌株和敏感菌株过氧化物酶活力测定
• 2.3 抗性菌株和敏感菌株酯酶同工酶电泳图谱
• 2.4 抗性菌株和敏感菌株可溶性蛋白质电泳图谱
• 3 讨论
• 第四章 抗戊唑醇禾谷丝核菌的渗透压敏感性及相对渗率变化
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 抗性菌株对渗透压的敏感性测定
• 1.3 药剂对抗性菌株细胞膜透性的影响测定
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性菌株对渗透压敏感性
• 2.2 药剂对抗性菌株细胞膜透性的影响
• 3 讨论
• 第五章 抗戊唑醇禾谷丝核菌对戊唑醇的吸收
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 样品的制备方法研究
• 1.3 样品的测定条件研究
• 1.4 不同抗药性菌株对戊唑醇的吸收研究
• 2 结果与分析
• 2.1 方法的线性范围
• 2.2 回收率及精密度结果
• 2.3 不同抗药性菌株对戊唑醇的吸收
• 3 讨论
• 第六章 抗戊唑醇禾谷丝核菌菌丝体内麦角甾醇和羊毛甾醇含量比较
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 麦角甾醇和羊毛甾醇样品的制备
• 1.3 麦角甾醇和羊毛甾醇样品的测定
• 1.4 药剂处理后不同抗药性菌株体内麦角甾醇和羊毛甾醇含量比较研究
• 2 结果与分析
• 2.1 方法的线性范围
• 2.2 回收率及精密度结果
• 2.3 药剂处理后不同抗药性菌株体内麦角甾醇和羊毛甾醇含量
• 3 讨论
• 第七章 抗戊唑醇禾谷丝核菌菌株的CYP51 基因片断克隆和序列比较
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 禾谷丝核菌CYP51 基因片断的扩增
• 1.3 PCR 产物的纯化回收
• 1.4 PCR 回收产物的连接
• 1.5 连接产物的转化
• 1.6 重组克隆的筛选与鉴定
• 1.7 序列测定和分析
• 2 结果分析
• 2.1 基因组DNA 的提取
• 2.2 CYP51 基因片段克隆
• 2.3 序列测定和分析
• 2.4 抗戊唑醇禾谷丝核菌不同菌株CYP51 基因片断序列比较
• 3 讨论
• 第八章 结论
• 第九章 讨论
• 1 禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性风险
• 2 禾谷丝核菌抗戊唑醇菌株的生理适合度
• 3 禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性机制
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读博士期间发表论文情况