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赤霉菌萜类代谢途径工程基础研究

2020-12-10阅读(936)

赤霉菌萜类代谢途径工程基础研究

论文摘要

作为倍受关注的有效抗癌药物紫杉醇,由于含量低、资源匮乏,其药源问题一直是基因工程天然药物生产研究的重点。为探索利用次生代谢能力很强的赤霉菌作为宿主菌,通过对其自身固有代谢途径的调控和改造,最终实现紫杉烯在赤霉菌中的组合表达,本论文开展了如下基础性研究:1.赤霉菌“鲨烯合酶”基因克隆、表达及功能鉴定本论文克隆得到赤霉菌鲨烯合酶（Gibberella fujikuroi squalene synthase,GfSQS）基因组序列及cDNA序列编码区,通过两个序列的比对分析,结果表明GfSQS基因组序列全长1550bp,含有3段内含子;GfSQS cDNA序列编码区全长1389bp,编码462个氨基酸,预测蛋白的分子量为53.4KD。将克隆得到的GfSQS cDNA编码区序列连接到原核表达载体pET-32（a）上,构建带有His Tag的GfSQS重组表达载体pET-SQS;并在大肠杆菌中进行异源表达,采用IPTG诱导,对影响蛋白表达的主要因素进行优化,表达产物使用Ni2+柱亲和层析方法纯化,表达产物电泳显示在约70KD处得到目的蛋白条带,并且在当宿主菌OD600达到0.9-1之间时加入0.8mMIPTG,在23℃诱导19小时后可获得较大量的表达产物。将纯化前后的重组蛋白加入到以FPP为底物的体外酶促反应体系中,反应产物用正己烷萃取后进行GC-MS分析。GC-MS产物化学分析表明重组pET-SQS表达产物可以催化FPP产生鲨烯,由此可鉴定GfSQS为赤霉菌鲨烯合酶基因。这项工作的完成为下调赤霉菌鲨烯合酶基因的表达研究奠定了基础。2.赤霉菌取代载体pMD3036FM（e）/HmB转化赤霉菌后,贝壳杉烯合酶（CPS/KS）阻断变株的筛选赤霉菌贝壳杉烯合酶基因（cps/ks）取代载体pMD3036FM（e）/HmB含有来自贝壳杉烯合酶基因序列的同源交换臂以及中间插入的潮霉素抗性基因表达框。对利用它转化赤霉菌后获得的一些转化子进行了筛选,一共得到了3个具有潮霉素抗性基因的转化子,它们有可能发生了3′-单交换。3.赤霉菌重组贝壳杉烯合酶基因（cps/ks）取代载体pMD3036FM（e）/hph/trpC的构建及转化赤霉菌的初步研究对原有取代载体pMD3036FM（e）/HmB进行改造,构建了新的取代载体pMD3036FM（e）/hph/trpC,该载体的特点为:上游交换臂采用不含任何启动子的部分贝壳杉烯合酶基因编码序列,与筛选标记基因——不含启动子的潮霉素抗性基因相融合。当取代载体与赤霉菌基因组DNA发生重组时,只有发生定向整合的转化子才能利用宿主原有的贝壳杉烯合酶启动子而正常表达潮霉素抗性,同时造成贝壳杉烯合酶基因被阻断。将该载体转化赤霉菌后获得了50余株抗性转化子,对其中的34株转化子进行了鉴定和筛选,尚未筛选到携带紫杉烯合酶基因的转化子,有3株潮霉素抗性转化子的同源整合情况有待深入研究,剩余的转化子仍有待继续鉴定。

论文目录

  • 目录
  • 符号缩写说明
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第1章 前言
  • 第2章 实验材料与设备
  • 第3章 赤霉菌鲨烯合酶基因的克隆、原核表达及功能鉴定
  • 3.1 实验方法
  • 3.2 结果与分析
  • 3.3 小结与讨论
  • 第4章 重组贝壳杉烯合酶基因取代载体与紫杉烯合酶基因表达载体（pITS1）共转化赤霉菌的初步研究
  • 4.1 实验方法
  • 4.2 结果与分析
  • 4.3 小结与讨论
  • 第5章 全文小结
  • 参考文献
  • 附录:测序图谱
  • 附:基于rDNA-ITS序列的冬虫夏草分子系统学研究
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1.前言
  • 2.实验材料和设备
  • 3.实验方法
  • 4.结果与分析
  • 5.小结与讨论
  • 参考文献
  • 附录
  • 文献综述一:萜类化合物丝状真菌组合表达的研究进展
  • 参考文献
  • 文献综述二:α-synuclein及相关帕金森病转基因模型的研究进展
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历、硕士期间发表论文及研究成果

    • 相关论文文献

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