论文摘要
植物内生细菌（Endophytic bacteria）是指定殖在植物组织内部但不引起明显病害症状的细菌。其具有促进植物生长、溶磷、抵抗病虫害侵袭等许多生物学作用,已成为多学科的研究热点。本研究在3个代表性高寒草地样地,即珠芽蓼草地（Polygonum grassland）、禾草草地（Grass grassland）和嵩草草地（Kobresia grassland）中选取五种优势牧草:珠芽蓼（Polygonum viviparum）、乳白香青（Anaphalis Lactea Maxin）、紫花针茅（Stipa purpurca Griseb）、线叶嵩草（Kobreasia Capillifolia）和秦艽（Gentiana macrophy pall）,应用传统微生物学和分子生物学相结合的研究方法,对其不同组织器官内生细菌的分离培养条件、拮抗菌筛选及其互作关系、生物学特性、抗菌物抗菌机理及拮抗菌的16Sr DNA鉴定进行了较为系统的研究,取得以下结果:1.内生细菌分离培养条件初探以乳白香青的根和叶组织为预试材料,通过对不同消毒剂、消毒时间、稀释梯度、培养基等因素的优化组合,得到较适宜条件为:牧草不同组织器官用0.1%SDS浸泡15min、3%NaClO浸泡3min、0.1%升汞浸泡10min、75%酒精12min处理后（各步间用无菌水冲洗34次）,研磨并稀释至10-3,取0.2ml涂布于TSA培养基,置28℃恒温培养57天,可分离到较多数量的内生细菌。用此方法,在上述五种高寒牧草的根、茎、叶、花组织中共分离到大小、形态、颜色各异的内生细菌315株。2.拮抗菌的筛选采用平板对峙法测定了315株内生细菌对10种植物病原真菌:辣椒立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani（pepper strain） kuhn Schl）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum （rape strain）（Lib） De Bary）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani （cotton strain） kuhn Schl）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum （egg plant strain） （Lib） De Bary）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum （schl） f.sp cucumerinum）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum （Pass） Leonard&Suggs）、玉米小斑病菌（Bipolaria maydis（Nisikado et Miyake） Shome）、小麦长蠕孢（Bipolaria.sorokiniana）、西瓜尖镰孢（Fusarium oxysporum f. Niveum）的拮抗作用,结果表明,有69株内生细菌对一种以上的植物病原真菌具有抑菌作用,占分离总株数的21.9%;其中47株对2种或2种以上的病原真菌有拮抗作用,占分离总株数的14.9%;17株抑菌谱广,对测定的10种真菌均具有不同程度的拮抗效果,占分离总株数的5.4%。3.内生拮抗菌互作关系研究亲和性互作测定表明,内生细菌互作关系多样,即X4与Z10、Q3、R1交互测试均完全亲和;但X4作为测试菌株时,与ZHC10是完全亲和,作为被测试菌株时,与ZHC10是基本不亲和。ZHC10作为测试菌株时,与Q3、R1是完全不亲和,与Z10、X4是基本不亲和,与ZB2是基本亲和;作为被测试菌株时,与Z10、Q3、R1、X4、ZB2均完全亲和。亲和性和混配后抑菌率之间关系为:互作关系亲和或不亲和混配后其抑菌率均有增有减。如菌株X4、Q3、R1和Z10完全亲和时,测定的对小麦长蠕孢病菌的抑菌率较单菌株抑菌率为高,其中Z10与R1混配后抑菌率提高8.3%;X4和Q3混配则提高6.5%,但对油菜菌核病菌的抑菌率与单菌株无差异;Q3与Z10表现不亲和,混配后对油菜菌核菌抑菌率提高9.3%,对小麦长蠕孢病菌抑菌率提高7.3%;ZHC10与R1表现不亲和,混配后对油菜菌核菌抑菌率降低18.1%。4.优选拮抗菌生理特性及生物学作用拮抗菌生理特性测定表明,菌株ZHC10和Z10菌体生长量分别在72h和60h达最大值,Q3、R1、X4和Z10在48h达最大值;菌株Z10、Q3、R1适宜pH为4-6,菌株ZHC10,ZB2,X4适宜pH为6-8;各菌株对NaCl浓度耐受范围为0-11%,其中ZHC10和ZB2耐盐性最好,分别为9%和7%。拮抗菌生物学作用测定表明,6菌株均有分泌IAA的能力,其中Z10分泌能力最强,为34.80μg/mL;R1最低,为0.58μg/mL。其中4株（Q3、R1、X4和Z10）具有溶磷性,ZHC10和ZB2无溶磷性。X4对无机磷溶解能力最大,D/d值为1.75;Q3最小,D/d值为1.48;各菌株D/d值在P<0.01时差异不显著。Q3对有机磷的溶解能力最大,D/d值为1.68;Z10最小,D/d值为1.26;菌株Z10与Q3,X4,R1对有机磷的溶解能力在P<0.01时差异极显著。5.抗菌物质稳定性及抑菌机理初探菌株ZB2、X4、ZHC10经15次转管培养后,抑菌带宽度较转代前无明显变化,拮抗效果稳定。3菌株产生的抗菌物质对热不稳定,60℃-80℃处理后,抑菌活性降低约50%;在pH6-8时,其抑菌活性较稳定。其拮抗物质处理油菜菌核病菌和小麦长蠕孢病菌72 h后,各病菌菌丝形态异常,出现膨大、扭曲,原生质凝集,顶端和中部出现泡状物,其破裂后原生质外溢,而对照菌丝光滑,均匀。其抑菌物质经盐析后,初步定性为蛋白质。6.拮抗菌的16SrDNA鉴定及其系统发育分析菌株ZB2、X4、ZHC10、Q3、R1经PCR扩增16S rDNA,测定的基因序列分别为:ZB2（1456bp）、X4（1456bp）、ZHC10（1456bp）、Q3（1465bp）、R1（1471bp）,其序列与GenBank中已报道的序列比较,结果表明:菌株Q3,R1与Serratia plymuthica （AJ233433）、Serratia plymuthica （ EU266583）相似性分别为99%;菌株X4与Serratia sp.（ DQ988935）相似性分别为99%;菌株ZB2与Bacillus sp.（EF612722）序列相似性为99%;菌株ZHC10与Bacillus sp.（EU082292）序列相似性为99%,结合培养性状、染色反应,初步确定菌株X4为Serratia sp,菌株Q3、R1为Serratia plymuthica;菌株ZB2和ZHC10为Bacillus spp.