论文摘要
研究背景男性不育研究一直是生殖医学研究的热点问题。研究表明一半以上的男性不育是因为精子活力低下、精子畸形以及精索静脉曲张和精子数量减少所致。因此,研究这些因素是治疗男性不育的有效方法。另一方面,全球人口的过度增长给环境和经济带来沉重的负荷,因此如何有效地控制人口的增长一直是生殖医学和人口学家们研究的热点。生殖医学已经为女性避孕提供了很多的方法。但是在男性避孕方面除了避孕套、输精管结扎、体外排精、定时节欲外,尚无有效、安全的方法。成功的男性免疫性疫苗应该是高效、安全、可逆性的。最近的研究表明在睾丸和附睾中特异分泌的附睾蛋白酶抑制蛋白（Eppin,epididymis protease inhibitor）在灵长类动物的生育中可能发挥重要的作用,与生殖和免疫性避孕关系密切。O′Rand等的研究证实,用重组Eppin免疫的雄猴不能使雌猴受孕,在这些雄猴的血清中Eppin抗体的滴度较高。王增军等进一步研究证实Eppin通过影响semenogelin-I（精液凝固蛋白酶）而发挥作用,他们认为Eppin-可能干扰了Eppin-semenogelin结合,从而使精液形成团块影响精液向前的运动。这些因素对授精会造成较大不良影响。尽管上述的这些研究说明Eppin对授精的重要性,但是,我们对人类Eppin和Eppin抗体的功能以及它们与人类不育关系的研究较少。为了证实人类Eppin抗体的存在及其在人类不育方面的重要意义,本实验采用有效的生物学方法重组了具有生物学活性的Eppin蛋白,同时用免疫组化等方法加以验证,证实重组His6-Eppin具有生物活性,对临床不育的诊断及免疫性避孕疫苗的研发提供了重要的实验基础。目的表达、鉴定和纯化重组的具有生物学活性的人类Eppin蛋白,为临床不育症患者的诊断和治疗提供坚实的实验基础。材料和方法材料TRIzol RNA提取试剂盒、逆转录试剂购自Invitrogen公司,限制性内切酶、T4DNA连接酶、dNTPs、琼脂糖凝胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司,pET-28a（+）原核表达载体和pCDNA3.1（+）真核表达载体分别购自Novagen和Invitrogen公司,His-SelectTMHC柱、蛋白A琼脂糖凝胶层析柱购自GE公司,引物合成和DNA测序均由大连宝生物公司完成。方法用TRIzol RNA提取试剂盒提取人睾丸组织总RNA,PCR引物设计根据已发表的Eppin基因序列（GeneBank accession No.BC053369）,缺失N-端分泌调控序列,上游引物:5’-GG-GGATCC（BamHI）-ctcttagcgaatgtccagggac-3’;下游引物:5’-GGG-CTCGAG（XhoI）-tcagggaaagcgtttattct-3’。RT-PCR产物连入pET-28a（+）载体,酶切鉴定,DNA测序确认后阳性重组克隆命名为pET28a-His6-Eppin。同样的方法获得pCDNA-Eppin真核表达载体。表达载体pET28a-His6-Eppin转化BL21（DE3）受体菌,挑单克隆菌LB培养液（卡那霉素50mg/L）37℃培养,OD600 nm达到0.6～0.8,不同条件下进行诱导表达3小时,6000g 4℃离心20分钟,诱导后菌体用PBS重悬,冰浴超声破碎,分别收集上清和沉淀,12%的SDS-PAGE判断目的蛋白表达水平。用His-SelectTMHC镍柱纯化重组蛋白His6-Eppin。具体操作为:50mL裂解缓冲液（50mM sodium phosphate,0.3M NaCl,pH 8.0）重悬菌体后,冰浴超声破碎后,4℃,12,000g离心20分钟,上清过预先经平衡缓冲液（50mM sodium phosphate,0.3MNaCl,10mM imidazole,pH 8.0）平衡的镍亲和柱,洗涤缓冲液（50mMsodium phosphate,0.3M NaCl,10～50 mM imidazole,pH 8.0）洗脱非特异性结合蛋白,重组蛋白用洗脱缓冲液（50mM sodium phosphate,0.3M NaCl,50～250mM imidazole,pH 8.0）洗脱,收集后用20 mMTris-HCl,200 mM NaCl（pH8.0）缓冲液4℃透析过夜。考马司亮兰染色蛋白定量,12%的SDS-PAGE分析蛋白浓度和纯度。6只8周龄雌性Balb/c小鼠购自上海SLAC公司,免疫程序为:第一次免疫,含30μgHis6-Eppin的100 ul PBS加100μl佐剂皮下注射;两周后进行第二次免疫,含60μg His6-Eppin的100 u1 PBS加100μl佐剂皮下注射,8天后,小鼠眼眶采血,测定血清效价。抗体纯化参照蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析柱使用说明书进行蛋白质纯化,纯化所得多克隆抗体加入50%的甘油于-20℃保存。纯化的His6-Eppin包被ELISA板,小鼠血清倍比稀释后加样,二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,TMB显色,于波长450nm的酶标仪上读数。提取人睾丸总蛋白,SDS-PAGE后转移NC膜,以小鼠抗His6-Eppin多抗为一抗（1:500稀释）,二抗为过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5,000稀释）。10μm人睾丸组织丙酮固定后制备冰冻切片,pCDNA-Eppin真核表达质粒用Lipofectamine 2000转染293T细胞,以小鼠抗His6-Eppin多抗为一抗（1:100）,Texas Red标记的抗鼠IgG抗体为二抗（1010-07SouthemBiotech,USA）,荧光显微镜激发波长615nm下观察,拍照。结果1、以人睾丸组织总RNA逆转录所得cDNA为模板PCR扩增获得360bp的Eppin片段,亚克隆进pET28a（+）,构建pET28a-His6-Eppin,经PCR鉴定及酶切片段大小确认,测序表明读码框正确,BLAST比对与报道序列一致（GeneBank accession No.BC053369）,表达质粒构建成功。将重组表达载体转入表达宿主菌BL21（DE3）。将Eppin DNA片段以同样的方法亚克隆进pcDNA3.1（+）,成功构建了真核表达载体pCDNA-Eppin。2、用1mM的IPTG于37℃、4h诱导细菌表达,在12%的SDS-PAGE上19KD处有一明显的表达条带,其分子量大小与融合蛋白His6-Eppin大小一致,但其主要在包涵体中。为得到可溶性的,具有生物活性的目的融合蛋白,我们降低了IPTG浓度和诱导温度,从SDS-PAGE和Quantity One软件分析（Figure 2.A）可看出,IPTG浓度从1mM降至0.5mM时,可溶性的目的融合蛋白从8%升至18%;诱导温度改为30℃时,可溶性蛋白所占比率变化不大,但当诱导温度降至26℃时,可溶性目的蛋白比率可达到40%,为37℃诱导温度下的5倍（Fig.2.B）。结果表明降低IPTG浓度和诱导温度可提高可溶性His6-Eppin的产量,因此我们选用0.5 mM IPTG于26℃大量诱导细菌表达来制备重组融合蛋白。3、用镍亲和层析柱对His6-Eppin融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE结果表明,从1L诱导细菌中最终得到约18.33mg的His6-Eppin融合蛋白。4、ELISA检测His6-Eppin蛋白免疫后小鼠血清抗体滴度为1:2,并用蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析柱进行了纯化。5、Western-blot为检测上述制备的多克隆抗体的特异性,将纯化后的鼠源抗His6-Eppin多克隆抗体与人睾丸组织总蛋白杂交后结果显示,在14kDa左右处有一明显条带（与组织中Eppin蛋白大小一致）,在12kDa左右处有一微弱条带。6、为进一步证实多抗的特异性,用所得多抗进行人睾丸组织切片免疫组化,荧光显微镜下观察可见,附睾组织大多数细胞胞浆和微绒毛有特异性红色荧光。对照组切片以非特异性的小鼠IgG为一抗则未见荧光。用Lipofectamine 2000转染试剂将真核表达质粒pCDNA-Eppin瞬时转染293T细胞系,固定后,以本实验纯化多抗为一抗,细胞免疫荧光后显示胞浆内有特异性红色荧光,而转染pCDNA3.1的细胞（阴性对照组）中未见荧光。结果表明真核表达载体可成功表达Eppin蛋白,并且可被抗His6-Eppin多克隆抗体识别。结论我们使用pET-28a质粒和镍亲和柱表达、纯化的重组人类Eppin蛋白具有生物学活性,这将进一步对临床不育症患者的诊断和治疗以及为男性免疫性避孕疫苗的研究提供坚实的实验基础。研究背景射精后的人类精子头部和尾部表面覆盖着丰富的Eppin蛋白质,这些蛋白质来源于睾丸和附睾。人类Eppin基因表达的3种mRNA最终仅编码两种蛋白亚型（1和3的蛋白质序列相同）,分别为Eppin 1和Eppin 2,这两种亚型之间的区别在于N端的氨基酸不同。其中Eppin 1是一种主要类型,它的mRNA编码133个氨基酸残基,相对分子质量（Mr）为15 284,1～21为信号肽,22～133为最终的成熟蛋白,因此是一种分泌蛋白;具有分泌信号的Eppin蛋白在理论上的等电点是8.52,相对分子质量（Mr）为15 283。而SDS-PAGE分析天然Eppin的单体形式明显的Mr为16 000～18 000。双体形式Eppin的表现Mr为33 000～36 000。这些蛋白质来源于睾丸和附睾,可能在灵长类动物的生育中发挥重要的作用。O′Rand以猴作为雄性免疫避孕模型进行了研究,他们将成年雄性猴用人类重组Eppin免疫,结果成功造成了与之交配的雌猴不孕,这些雄猴血清中检测到了高滴定度Eppin抗体,尽管实验已经证实Eppin与授精的关系密切,但是人类精液中是否存在抗Eppin抗体?如果存在,那么它与男性不育之间的关系如何?这些问题尚不明确。本实验使用有效的分子生物学方法,获得了大量的重组Eppin蛋白,首次在抗精子抗体阳性的不育患者精液中发现了抗Eppin抗体的存在。为不断拓宽不育症患者辅助诊断指标、加强不育症患者的特异性治疗,同时也为基于Eppin的新型免疫避孕疫苗的研发提供了一定的实验和临床研究基础。目的本研究的目的是用重组的人类Eppin蛋白作为抗原,检测抗精子抗体阳性的不育患者精液中的抗Eppin抗体的存在和水平,并探讨抗精子抗体阳性的不育患者精液中抗Eppin抗体检测的临床意义。方法25例不育患者的精液标本来自男性不育症门诊,入选标准为:结婚2年以上、性生活正常、未采用任何避孕措施、经男科检查同时其配偶经妇科检查均排除器质性疾病、精液抗精子抗体检测阳性的不育男性患者。25例正常对照组的男性精液标本取自自愿捐献者,入选标准为:无免疫性疾病、有生育史、精液抗精子抗体检测阴性的男性患者。其中抗精子抗体阳性组平均年龄（28.51±3.38）岁,正常对照组平均年龄（29.74±5.36）岁。抗精子抗体阳性组既往有前列腺炎病史4例、附睾炎病史1例、非特异性尿道炎病史2例,正常对照组既往无泌尿生殖系统感染病史。精液标本ELISA分析:用0.05M PH 9.6碳酸盐包被缓冲液将纯化的重组蛋白His6-Eppin稀释至蛋白质含量为10μg/ml。在每个聚苯乙烯板（Nunc,Roskilde,Denmark）的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗5次。加一定稀释的待检精液样品于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。于各反应孔中,加入新鲜稀释的（经滴定后的稀释度）HRP标记的羊抗人IgG抗体0.1m1。37℃孵育0.5～1小时,洗涤。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1m1,37℃10～30分钟。在ELISA检测仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔0·D值。精液标本Western blot分析:纯化重组蛋白His6-Eppin样品,加入RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,150 mM NaCl,0.1%SDS,1%NP40,1 mM phenylmethylsulfonylfluoride,5μg/ml aprotinin,and 5μg/ml leupeptin.）,稀释的抗精子抗体阳性不育患者精液标本作为一抗（1:500）,peroxidase conjugated羊抗人Ig G（Sigma）作为二抗（1:5,000）,Odyssey扫描系统进行分析与扫描。结果ELISA法检测25例抗精子抗体阳性的不育患者精液中有7例（28%）阳性（分别为第3,4,9,14,17,19和22号标本）。然后使用Western blot方法进一步检测7例阳性患者的精液标本,发现其中有5例阳性表达（分别为第3,4,14,19,22号标本）。25例可以正常生育的男性精液中抗Eppin抗体为阴性表达。结论1、本实验证实在抗精子抗体阳性的不育患者精液中存在抗Eppin抗体,抗Eppin抗体可以通过干扰正常Eppin对精子表面和semennogenlin的相互作用及其对附睾上皮的保护,影响精子成熟和射精后固化,从而导致患者不育。2、精液中抗Eppin抗体的检测为不断拓宽不育症患者辅助诊断指标、加强不育症患者的特异性治疗,同时也为基于Eppin的新型免疫避孕疫苗的研发提供了一定的实验和临床研究基础。