内毒素血症大鼠心肌细胞骨架蛋白基因表达的变化

论文摘要

由革兰氏阴性菌感染时,细菌胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）大量释放入血可造成内毒素血症,常引起机体广泛的失控性炎症和免疫反应,导致机体出现休克、全身炎症反应综合症、混合性免疫拮抗综合症、多器官功能衰竭等广泛的损害和影响。对体内重要的器官-心脏来说,LPS还可导致心肌收缩力减弱、心率减慢,严重影响心脏功能。但LPS是否对心肌组织有直接的损害以及这种损害的作用机制如何,目前并不清楚。由于心肌病的研究提示心肌细胞骨架蛋白变化对心功能有较大影响,我们推测LPS可能对心肌细胞骨架成分也会产生干扰和损害作用。本室前期的研究工作表明,LPS可引起心肌细胞内纤维状肌动蛋白（F-Actin）、结蛋白（desmin）等骨架蛋白的形状分布和含量发生变化。LPS可使心肌细胞皮质部分F-Actin染色密度降低,细胞内排列异常,形成应力纤维;LPS刺激幼鼠心肌细胞8小时,可见心肌细胞内desmin免疫荧光染色强度显著降低,desmin分布变得不规则。上述骨架蛋白含量减少、发生变形及应力纤维的形成可能是LPS导致心肌舒缩功能降低的重要原因之一。心肌细胞骨架蛋白的含量及分布变化可能与基因转录、翻译表达水平的改变、骨架蛋白的解聚与失活等因素有关。由于前期免疫荧光染色检测显示细胞骨架蛋白在蛋白质表达水平有变化,因此本研究拟运用RT—PCR等方法深入一步观察心肌细胞骨架蛋白在基因转录水平是否也有变化,为深入探讨心肌细胞骨架蛋白变化的机制提供有益的参考。本研究采用LPS刺激心肌组织和细胞,用RT—PCR方法检测心肌细胞骨架蛋白肌动蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）和结蛋白（Desmin）的转录活性变化;观察心肌细胞损伤指标—血浆肌酸激酶（CK）的活性变化,连续监测左心室舒张功能的指标[左心室舒张末压（left ventricular end diastolicpressure,LVEDP）和左心室内压最大下降速率—dp/dt max]和反映左心室收缩功能的指标[左心室收缩压（left ventricular systolic pressure,LVSP）和左心室内压最大上升速率+dp/dt max]的改变情况,以探讨LPS作用于心肌后影响心肌细胞收缩和舒张功能的可能途径和机制。实验中采用沙门氏菌属的精制内毒素注入wistar大鼠体内（10mg/kg体重）复制内毒素血症模型,观察以及检测大鼠的心功能变化,结果显示,注射内毒素后4—8小时,部分实验动物出现心跳呼吸加快、鼻腔喷出白色淡黄色、粉红色泡沫痰等典型的急性左心衰竭表现。心功能指标方面,HR、LVSP、+dp/dt max、—dp/dt max均显著下降,而LVEDP下降并不明显。与对照组相比HR、LVSP、+dp/dt max、—dp/dt max指标存在显著性差异,而LVEDP指标差异不显著。上述实验结果提示,LPS对心功能的负性作用很可能以降低心肌收缩能力为主。LPS不仅引起心肌功能学方面的变化,而且可使心肌细胞显微结构发生显著改变。大鼠一次性给与注射LPS（10mg/kg体重）处理,8小时后光学显微镜下可见LPS心肌组织出现渗血现象,心肌细胞横纹不清晰,胞浆内可见中毒颗粒。48小时后存活大鼠的上述病理改变仍未恢复正常。内毒素处理4h组、8h组、24小时组的大鼠心肌细胞,经电子显微镜检查可发现随着内毒素作用时间的延长,纤维方向及横纹逐渐模糊消失、线粒体嵴也逐渐减少,细胞间质（间质细胞、血管等）受损加重,细胞间隙明显变大,但纤维溶解现象并不明显。以GAPDH为内参照的情况下进行了三种骨架蛋白的基因表达水平检测。用RT—PCR方法逆转录并扩增了肌动蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）、结蛋白（Desmin）mRNA,水平琼脂糖电泳、EB荧光染色及凝胶光密度图像分析进行半定量检测。结果显示,注射内毒素后32小时内各组Actin转录水平与0小时组比较没有显示出显著性差异;40小时之后转录水平显著上升（2.231±0.545,与0小时组比较P=0.000）,之后维持在较高水平,直至72小时仍显著高于0小时组:注射内毒素后Tubulin转录水平16小时以内的变化无显著差异,24小时则较前显著降低（0.749±0.090,与0小时组比较P=0.027）,32小时仍维持低水平（0.759±0.067,与0小时组比较P=0.031）,然后回升维持在接近注射前的水平,72小时内未见表达的高峰。而Desmin基因表达水平没有明显改变。值得注意的是,这几种细胞骨架蛋白的变化趋势与组织的总RNA含量变化趋势并不一致。可能是在此应激状态下组织细胞动员较多的调控机制以增加某些功能蛋白如一些热休克蛋白的表达,而对属于结构蛋白的细胞骨架蛋白的表达暂时退居次要地位。本实验中未检测到内毒素对大鼠血浆肌酸激酶活性的影响,数据显示各时间点血浆CK值无显著性差异。可能与样本量较小、数据的离散性较大有关。根据以上研究我们可以得出以下初步结论:（1）在整体水平上,本实验证实LPS对实验动物的心功能有明确的损害,而且此损害以降低收缩功能为主,对舒张功能的影响可能没有收缩功能那么显著。（2）在组织水平上,LPS长时间（8小时）刺激后可使心肌组织出现细胞骨架结构的损害,横纹不清晰,胞浆出现中毒颗粒,部分细胞发生凋亡。（3）在基因表达水平,LPS可引起心肌细胞骨架蛋白Actin和Tubulin基因表达发生显著的变化,而Desmin基因表达变化不明显。表明心肌细胞骨架蛋白的改变可能是内毒素引起心功能降低的重要机制之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 实验仪器及试剂
• 实验方法
• 结果
• （一） LPS对大鼠在体心功能的影响
• 1、LPS对在体大鼠心率的影响
• 2、LPS对在体大鼠LVEDP变化的影响
• 3、LPS对在体大鼠LVSP变化的影响
• 4、LPS对在体大鼠+dp/dt max变化的影响
• 5、LPS对在体大鼠—dp/dt max变化的影响
• （二） LPS对血浆肌酸激酶活性的影响
• （三） LPS对心肌细胞显微结构的影响
• 1.光镜检查
• 2.电子显微镜检查
• （四） 心肌骨架蛋白基因表达水平的变化
• 1.内毒素作用时间对大鼠心肌组织总RNA含量的影响
• 2.内毒素作用时间对大鼠心肌细胞骨架蛋白基因表达水平的影响
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢