论文摘要
文昌鱼（Amphioxus）是一种头索动物，被认为是现存最接近于脊椎动物的无脊椎动物，是研究动物胚胎发育和动物进化的典型材料。本工作首次克隆了文昌鱼中与发育密切相关的hedgehog信号通路的三个成员，包括patched（ptch），smoothened（smo），gli，以及与细胞分化密切相关的Rbx1基因，并研究了它们在mRNA水平的发育表达图式及其系统进化，此外还首次在蛋白水平研究了Toll-like receptor在文昌鱼中的表达情况。本文的一系列原创性研究成果为揭示文昌鱼的发育机制和阐明动物的进化提供了重要资料。运用佛罗里达文昌鱼基因组数据库（http://www.genome.jp）并通过在GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行网上比对，在核苷酸保守区域设计简并引物，利用RT-PCR我们得到hedgehog信号通路中三个重要基因即ptch，smo和gli的EST序列。它们可分别编码由374，151，134个氨基酸组成的多肽，与其它物种相应蛋白的一致性较高，分别在44％-57％，47％-67％和90％-94％之间，故将它们分别命名为Amphi-ptch，Amphi-smo和Amphi-gli。这也表明hedgehog信号通路成员在进化上的保守性。选取其它脊椎动物和无脊椎动物的PTCH，SMO和GLI蛋白及相应的同源蛋白，采用neighbor-joining的方法构建进化树，结果分析显示，文昌鱼中三个基因的进化规律均符合动物分类学中的进化地位，而且文昌鱼PTCH，SMO和GLI蛋白均单列一枝，位于脊椎动物的基部，说明它们可能歧化于脊椎动物相应基因出现多态性和基因倍增之前。胚胎原位杂交的结果显示，Amphi-ptch在约12h早神经胚的预定脊索和中内胚层表达。到14h神经胚，Amphi-ptch在脊索，分化中的体节以及消化道内胚层表达。这种表达模式在神经胚期一直持续。到20h神经胚期，Amphi-ptch在脊索的表达消失，而只在分化中的体节和消化道上皮表达。而且这种表达模式一直持续到48h幼虫期。Amphi-smo基因的转录产物首先在10b早神经胚期内中胚层检测到。在14h神经胚，Amphi-smo在正在形成的体节以及消化道内胚层表达。到20h神经胚，Amphi-smo在将要形成的体节中表达减弱，在消化道分化中的内胚层上皮仍有表达。这种表达模式一直持续到36h。到48h，仅在消化道上皮的右侧壁检测到Amphi-smo的表达。Amphi-Gli的表达模式与Amphi-ptch非常相似。从发育开始一直到原肠胚晚期未检测到Amphi-gli基因的转录产物。在约12h早神经胚，Amphi-gli开始在预定脊索和中内胚层表达。到14h神经胚，Amphi-gli在脊索，分化中的体节以及消化道内胚层表达。这种表达模式在神经胚期一直持续。到20h神经胚期，Amphi-gli在脊索的表达消失，而只在分化中的体节和消化道上皮表达。而且这种表达模式一直持续到48h幼虫期。这些表明，文昌鱼中hedgehog信号通路，至少是这三个基因在中内胚层的发育和分化中起重要作用。我们从cDNA文库中得到一段全长726bp的序列，编码一段111个氨基酸残基组成的蛋白质，此蛋白与其它物种的Rbx1蛋白一致性很高，在74％-86％之间。通过分析得知，该基因演绎得蛋白包含一个保守的RING-box结构域，故命名为AmphiRbx1（GenBank accession number：DQ866806）。选取一些典型脊椎动物和无脊椎动物的同源蛋白，用邻近相连法构建进化树。分析显示，在Rbx1谱系中，文昌鱼单列一支并位于脊椎动物群的基部，其进化规律符合动物分类学中的进化地位。原位杂交表明，在文昌鱼0-72h发育的各时期都能检测到AmphiRbx1基因的表达。在受精卵到卵裂早期明显可以检测到AmphiRbx1的转录物，接着AmphiRbx1的表达在囊胚期下调，在原肠期AmphiRbx1在分化中的中内胚层表达。到大概9.5h的神经胚期，可以在神经板，前体节中胚层，预定脊索中胚层和分化中的原肠检测到AxphiRbx1 mRNA。随着胚胎发育，表达集中在正在形成中的体节，肠，鳃和尾芽部位。在脊索和体节形成之后，AmphiRbx1的表达下调，在早期幼虫阶段，仍然可以在分化中的鳃和尾芽中看到AmphiRbx1的表达。原位杂交和RT-PCR的结果表明在成体的肠上皮细胞，鳃绒毛和上皮，脊索，肌肉细胞，卵巢和精巢中也可以检测到AmphiRbx1的表达信号。可见AmphiRbx1的表达主要集中在正在形成的器官和活跃增殖的组织细胞，如正在发育的神经管，脊索，体节，肠，鳃弓和咽，表明AmphiRbx1很可能与文昌鱼胚胎发育过程中的细胞分裂有关，但是关于它的确切功能还有待于进一步研究。本文首次在蛋白水平上研究了toll-like receptor2（TLR2）在成体文昌鱼中的表达情况。我们用免疫组化的方法检测了其在文昌鱼中的表达情况，并用小鼠作阳性对照。结果表明，在文昌中，TLR2蛋白在肝盲囊，肠，鳃，背部神经索，体腔上皮细胞中均有表达。在卵巢中能检测到TLR2的表达，但在精巢中检测不到。TLR2在肠和肝盲囊的上皮细胞中表达最强，且主要集中在上皮细胞微绒毛中，特别是位于胞质膜顶部的内吞泡中。在神经索中，TLR2在近中央神经管的神经元细胞中表达。在每一个鳃瓣中，鳃血管，体腔细胞，色素上皮束和鳃隔轴上均有TLR2的表达。在内柱中，特别是在位于腺细胞顶部的分泌泡也检测到TLR2的表达。体腔壁和体腔中的巨噬细胞均有阳性反应。另外，我们在文昌鱼的表皮以及真皮下淋巴隙中的巨噬细胞也观察到阳性表达。研究结果表明，文昌鱼中存在TLRs样蛋白，而且至少与脊椎动物的TLR2具有很高的同源性。它不仅在文昌鱼某些器官的发育中起作用，而且在成体文昌鱼皮肤，体腔壁和体腔内巨噬细胞，肠上皮以及鳃上皮等与天然免疫有重要作用的部位表达，表明TLR2在文昌鱼天然免疫中起一定的作用，为文昌鱼天然免疫的研究提供了新的资料。