论文摘要
催产素（Oxytocin,OT）经典的生理作用是诱发子宫收缩和促进泌乳。近年来,越来越多的研究表明OT也参与调控胃肠道的运动、感觉和免疫等功能。虽然关于OT影响胃肠道运动的报道已有很多,但是研究结果由于实验方法不同、实验动物种属的差异以及研究肠道部位的不同而不尽相同。人类胃肠道全程都有OT和OT受体的基因和蛋白质的表达,说明OT可能是一种胃肠激素,但消化道上何种细胞表达OT还没有确定。在女性,结肠功能紊乱非常常见,肠道功能也通常会跟随月经周期而发生规律性改变。虽然有报道显示其原因与女性体内雌激素和孕激素周期性变化有关,但具体机制不清。雌激素可以上调子宫平滑肌和中枢内的OT受体表达,从而增加这些脏器对OT的敏感性,但雌激素对消化道上的OT受体是否有相似的作用尚未见报道。我们推测:生理周期中雌激素水平的波动也会影响到大鼠结肠OT受体的敏感性和表达量,从而引起结肠运动功能的周期性变化。为了证实这个假设,我们采用监测结肠肠道压力和结肠肌条张力的方法分别在整体和离体水平研究了OT对结肠运动的作用,并探讨了雌激素对这种作用的影响;通过Western Blot和RT-PCR技术研究了雌激素对大鼠结肠OT受体蛋白和mRNA表达的影响,用免疫组化方法定位了大鼠结肠表达OT受体的细胞类型。材料和方法实验动物实验采用健康成年雌性大鼠,部分大鼠接受双侧卵巢切除术（OVX）,其余大鼠实验前不接受任何手术,根据大鼠所在的时段不同将大鼠分成三组:动情前期、动情期和动情间期。将体重200-220克的雌性Wistar大鼠轻度乙醚麻醉,大鼠失去痛觉反射后,开始手术。腹部剪毛并常规消毒,在左右下腹各做一厘米的切口,分离卵巢并切除,结扎子宫以止血。缝合肌层和皮肤并用碘伏消毒后将大鼠放回笼中饲养。饲养过程中经常更换消毒处理过的垫料。两周后将OVX大鼠随机分成四组:三组分别皮下注射不同剂量的雌激素(4,25,100μg kg-1,s.c.)作为处理组;一组注射芝麻油作为对照组。每天注射一次连续注射六天,最后一次注射24小时后开始实验。阴道分泌物涂片法分辨正常雌性大鼠的生理周期。子宫重量和血清雌激素水平的测定将大鼠断头牺牲,取出子宫并称重,迅速取血,将全血放入离心机中3000转离心30分钟以分离血浆,将血浆放入4℃冰箱保存。血浆雌激素水平使用自动电化学发光免疫分析仪测量。离体肌条的制备和张力监测大鼠实验前禁食12小时,自由饮水。快速牺牲大鼠,迅速取出远端结肠（距离肛门5-7 cm）,放置在充满柯氏液的培养皿中,持续供给含95%氧气和5%二氧化碳的混合气体。在培养皿中将结肠沿肠系膜方向剪开,并沿与纵行平滑肌纤维平行的方向取出结肠远端纵行肌肌条（8×3 mm）,展开平铺于培养皿中,用清洁图钉固定。将各个肌条分别安置于灌流肌槽中,每个肌槽中均盛有5 ml37℃Krebs液并持续供给95%O2和5%CO2混合气体。肌条的一端固定在肌槽底部的玻璃挂钩上,另一端连接张力换能器（JH-2B,成都设备公司,中国成都）,肌肉张力信号在生物信号记录分析系统（SMUP-PC,上海嘉龙教学仪器厂,中国上海）上记录及分析。肌条在1 g的前负荷下孵育45 min-60 min（每隔10 min用新鲜37℃Krebs液冲洗肌条）,待肌条自发收缩活动平稳后加入不同浓度的OT,观察肌条收缩情况的变化。在体实验中大鼠结肠运动的监测腹腔注射异戊巴比妥钠麻醉大鼠,并将其固定在恒温手术台上,给予气管插管和股动脉插管,以保证大鼠呼吸通畅和监测动脉血压。将固定在塑料管上的气囊涂上石蜡油之后插入大鼠结肠,塑料管的另一端连接压力换能器（YP-101;新航兴业科技公司,中国北京）。压力变化经过生物信号放大器（ML136;埃德仪器有限公司,悉尼,澳大利亚）放大后,通过多导生物记录仪（Powerlab 8SP;埃德仪器有限公司,悉尼,澳大利亚）进行记录和分析。气囊内冲入水大约0.7ml,使囊内压力维持在10mmHg左右,待40min后结肠压力稳定静脉注射各种试剂,观察结肠压力的变化。Western blot牺牲大鼠后取出约1cm长的远端结肠,匀浆并提取蛋白质。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,转膜。PVDF膜经过一抗孵育过夜,二抗孵育一小时,最后加入ECL kit显影。RT-PCR牺牲大鼠后取出约1cm长的远端结肠,trizol内匀浆并提取RNA。按照ABI反转录试剂盒的说明进行RNA反转录,扩增引物购自Invitrogen公司。免疫组织化学OVX大鼠皮下注射不同剂量的雌激素或芝麻油六天后牺牲,取出远端结肠,柯氏液清洗后将组织放入4%多聚甲醛固定过夜,第二天自来水流水冲洗1小时。经过脱水、透明、浸蜡、包埋。待蜡成型后进行组织切片,厚度为4um,一抗4℃孵育过夜;二抗孵育30min。山羊抗OTR多克隆抗体,兔抗山羊抗体（二抗）购自生物晶美。采用DAB显色剂使免疫阳性细胞显色。统计学处理指标变化用均数士标准误（mean±SEM）表示,用单因素方差分析检验加入OT后不同时间段结肠运动的变化,以P<0.05为显著性差异界值。结果:1.雌激素（4-100μg/kg/天×6天）可以剂量依赖性的提高血浆雌激素水平和子宫重量。OT兴奋雌性大鼠在体和离体大鼠结肠运动,雌激素处理后大鼠结肠对催产素敏感性明显强于对照组。2.大鼠的动情周期中,动情前期和动情期的雌激素水平高于动情间期,与此相对应,大鼠处于动情前期和动情期时,相同剂量的催产素对结肠运动的兴奋作用明显强于动情间期。3.静脉注射催产素特异性受体阻断剂atosiban后再给予OT,OT兴奋结肠运动的作用受到明显抑制。4.电压依赖性Na+离子通道阻断剂TTX完全阻断了催产素对远端结肠纵行肌的兴奋作用。5.静脉注射加压素引起结肠运动的抑制,与OT的作用相反。6.雌激素明显提高OVX大鼠结肠的OT受体蛋白和mRNA的表达水平。7.免疫组化实验发现催产素受体在肌间神经丛中表达,经过雌激素处理的OVX大鼠结肠OT受体免疫阳性细胞明显增多。结论1.OT通过肠神经丛上的OT受体兴奋雌性大鼠远端结肠的运动。2.雌激素上调大鼠结肠对OT的敏感性,这种作用可能是通过上调远端结肠OT受体的表达引起的。