巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部的定殖固氮芽孢杆菌的分离及其glnB基因的研究

论文题目: 巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部的定殖固氮芽孢杆菌的分离及其glnB基因的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 刘元

导师: 陈三凤

关键词: 标记,激光共聚焦扫描显微镜,固氮芽孢杆菌,电转化

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 论文的第一部分研究了巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部的定殖。将pGFPmut2质粒中的gfp基因（编码绿色荧光蛋白）克隆到载体pVK100（可在巴西固氮螺菌中复制）上,构建成重组质粒pVK1001。将pVK1001通过电转化方法导入到巴西固氮螺菌Yu62中,经检测带有gfp基因的质粒在该菌中能稳定表达,这样就获得了GFP标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株。用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米（农大3318）幼苗,在接种8天、12天后,取其根部,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测。结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株可侵入到玉米根部皮层的薄壁细胞间隙。用扫描电镜和超薄切片电镜观察,可得到相同的结论,大多数细菌主要定殖于根表,少数菌可进入玉米根组织内。 论文的第二部分是关于两株固氮芽孢杆菌的分离和鉴定。首先采集土壤样品,来自中国农业大学科学园区不同作物的根际,以及药用植物园内多种木本和草本植物根际。用严格的筛选确定有固氮能力的芽孢杆菌,初筛程序包括:土壤悬液经80℃水浴消煮,取稀释液涂无氮平板,分离、纯化无氮平板上的单菌落,获得15株菌落形态上有所区别的菌株。继而以这15株总DNA为模板,扩增固氮酶结构基因nifH片段;用液体法检测固氮酶活,酶活仅在有氧时从部分菌株中可测得,厌氧时所有菌株均测不到酶活;以一株芽孢杆菌中扩增的部分nifH标记为探针,同15株菌株酶切的总DNA进行Southern杂交。综合PCR扩增结果、酶活检测结果和杂交的阳性信号,证明其中两菌株为可固氮的芽孢杆菌,经16S rDNA测序初步鉴定为Bacillus megaterium C4和Paenibacilluspolymyxa N4。其中菌株C4的性状较好,构建了C4基因组的λ噬菌体文库。 论文的第三部分是关于从固氮芽孢杆菌中克隆glnB基因。用自行设计合成的简并引物,从B.megaterium C4和Paenibacillus polymyxa G2（本实验室分离的固氮菌）中进行PCR扩增得到glnB的部分序列。同源性分析表明,B.megaterium C4中的glnB基因的编码产物即PⅡ蛋白与Rhodospirillum、Magnetospirillum及Azospirillum属各菌株的PⅡ蛋白同源性较高;P.polymyxa G2中的glnB基因的编码产物即PⅡ蛋白与Pseudomonas、Xanthomonas、Burkholderia及Azoarcus菌属各菌株的GlnB/GlnK蛋白有较高同源性,但与枯草芽孢杆菌中的PⅡ同源蛋白即NrgB序列相比同源性均较低,小于50%。为了通过突变体DNA酶切、自连的方法获得glnB的全基因序列,构建了多种整合载体,带有可在阳性菌中表达的多种抗生素抗性标记。将带有温度敏感型复制子的阳性菌质粒pE194,改造为芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体,转化芽孢杆菌宿主后可通过控制温度使其同样起到整合载体的作用。多次用不同方法转化菌株C4,但均没有成功。就菌株G2的电转化条件,从washing buffer、菌体生长的OD600值、向buffer中添加各种细胞壁形成的干扰物质、在复育培养基中加入高渗剂,以及电场强度等多方面进行了优化,最终可使转化率达到103-104转化子/μgDNA,且该结果具有可重复性。在此基础上用构建的整合载体转化G2菌株,但没有筛选到正确的单交换突变体。同时,已转化有pE194温度敏感复制子构建质粒的G2菌株,在43-48℃温度范围内培养,不能得到同源单交换的突变体,但可得到理论上以很低机率发生的不依赖于同源片段的异常重组。因此,推测在Paenibacillus polymyxa G2中小于300bp的片段可能不足以导致同源重纪。

论文目录:

第一章 文献综述

1.1 固氮芽孢杆菌研究进展

1.2 P_Ⅱ蛋白的研究进展

1.3 芽孢杆菌遗传学研究方法进展

1.4 绿色荧光蛋白基因(gfp)及其应用

第二章 材料和方法

2.1 菌株和质粒

2.2 培养基和抗生素

2.3 酶及试剂

2.4 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部定殖的研究

3.2 两株固氮芽孢杆菌C4和N4的筛选

3.3 C4菌株一些相关性状的研究

3.4 C4菌株λ噬菌体文库构建

3.5 两菌株glnB部分基因克隆及测序

3.6 多粘芽孢杆菌G2glnB基因克隆

第四章 总结与讨论

4.1 总结

4.2 讨论

参考文献

附录

致谢

简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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• [2].固氮蓝藻在松嫩平原盐碱土生态修复中作用的研究[D]. 张巍.哈尔滨工业大学2008
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