低聚壳聚糖诱导毛白杨抗病性的基因差异表达研究

论文摘要

毛白杨（Populus Tomentosa）是我国北方常见的行道树和防风林树种,生长快材色好,具有良好的生态及经济价值。但困扰毛白杨的病虫害种类较多,经常造成严重的经济损失。传统的化学农药治理危害环境且促生病虫害抗药性;多次改良育种难度太大,而低聚壳聚糖作为能诱导植物抗病性的外源激发子,具有很好的作为无污染的生物农药的应用前景。本研究的主要目的是筛选出最具生物活性的低聚糖的氧化法制备工艺,研究该低聚糖对毛白杨愈伤组织基因差异表达的影响,为进一步研究低聚糖诱导毛白杨抗病的分子生物学机理做基础性研究。选择壳聚糖和毛白杨愈伤组织为研究对象,釆用2%乙酸做介质,过氧化氢氧化法降解壳聚糖,通过对反应条件的控制得到四种平均聚合度的低聚糖激发子;用不同浓度的低聚糖处理毛白杨愈伤组织,检测愈伤组织PAL与几丁质酶活性变化情况,经过比较得到最具生物活性的低聚糖;用该低聚糖处理毛白杨愈伤组织后检测不同时间点基因的差异表达。本研究结果如下:（1）四种低聚糖都具有诱导活性,75mg/L的平均聚合度为10.02的低聚壳聚糖具有最佳的生物学活性。（2）最佳制备工艺:30%过氧化氢与壳聚糖单体摩尔比为0.8,壳聚糖质量与2%乙酸体积比为1:20,60℃下搅拌反应6小时,调节PH至8.5左右,向抽滤下相中加入3倍体积预冷的无水乙醇,沉淀12h,抽滤,所得沉淀用75%乙醇洗一遍,3500rpm离心15min,无水乙醇洗沉淀后4000rpm离心15min（重复此过程三遍）,弃上清后沉淀冷冻干燥。（3）75mg/L的平均聚合度为10.02的低聚壳聚糖溶液处理毛白杨愈伤组织后4小时、6小时、24小时和48小时提取愈伤组织总RNA,釆用DDRT-PCR和快速银染方法对诱导表达的差异基因进行显示。6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果初步表明,低聚糖处理使愈伤组织在各时间点出现了上百条差异片段。其中诱导4小时出现表达上调片段144个,6小时出现表达上调片段74个,24小时出现表达上调片段108个,48小时出现表达上调片段94个。PCR二次扩增回收的产物还需再做反向Northern斑点杂交以除去假阳性得到真正的差异表达基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 毛白杨研究概况
• 1.2.1 毛白杨形态特征
• 1.2.2 毛白杨生理生态特性
• 1.2.3 毛白杨生理及生态价值
• 1.2.4 毛白杨经济价值
• 1.2.5 毛白杨育种进展
• 1.3 低聚壳聚糖研究概况
• 1.3.1 低聚壳聚糖制备研究进展
• 1.3.2 低聚糖生物学活性研究概况
• 1.3.3 低聚糖诱导植物抗病反应机理研究进展
• 1.4 几丁质酶与植物抗病性
• 1.5 苯丙氨酸解氨酶与植物抗病性
• 1.6 mRNA 差异显示反转录技术研究进展
• 1.7 银染显色法研究进展
• 第二章 最佳平均聚合度低聚壳聚糖筛选
• 2.1 不同平均聚合度低聚壳聚糖制备
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.2 低聚糖平均聚合度测定
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.3 低聚糖生物学活性确定
• 2.3.1 毛白杨愈伤组织培养
• 2.3.2 毛白杨愈伤组织处理
• 2.3.3 不同浓度的低聚壳聚糖激发子对毛白杨愈伤组织苯丙氨酸解氨酶活性的影响的测定
• 2.3.4 不同浓度的低聚壳聚糖激发子对毛白杨愈伤组织几丁质酶活性的影响的测定
• 2.3.5 讨论
• 2.4 具有最佳生物活性的低聚糖的确定
• 2.4.1 最佳浓度的不同聚合度低聚糖对毛白杨愈伤组织PAL 活性的的影响比较
• 2.4.2 最佳浓度的不同聚合度低聚糖对毛白杨愈伤组织几丁质酶活性的的影响的比较
• 2.4.3 结果与分析
• 2.5 讨论
• 第三章 低聚壳聚糖诱导毛白杨愈伤组织抗病性的基因差异表达
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 材料处理
• 3.2.2 不同诱导时间的毛白杨愈伤组织总RNA 提取
• 3.2.3 毛白杨愈伤组织cDNA 第一链的合成
• 3.2.4 毛白杨愈伤组织DDRT-PCR 扩增
• 3.2.5 DDRT-PCR 产物的6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.6 快速银染法显色
• 3.2.7 差异片段的回收
• 3.2.8 差异条带的二次PCR 扩增
• 3.2.9 PCR 扩增产物的回收
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 毛白杨愈伤组织总RNA 提取
• 3.3.2 不同处理时间的愈伤组织的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
• 3.4 讨论
• 第四章 讨论
• 4.1 氧化法制备生物活性低聚壳聚糖的最佳工艺条件
• 4.2 低聚壳聚糖对毛白杨愈伤组织抗病性的影响
• 4.3 低聚壳聚糖处理对毛白杨愈伤组织基因表达的影响
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介