论文摘要
第一部分原癌基因c-Met在鼻咽癌组织中的表达及临床意义目的：检测原癌基因c-Met在鼻咽癌组织中的表达及临床意义,探讨其在鼻咽癌侵袭转移过程中的作用。方法：采用免疫组织化学SP法和RT-PCR分别检测31例鼻咽癌及10例慢性鼻咽炎性组织中c-Met蛋白及c-Met mRNA的表达水平,并联系其临床病理资料。结果：c-Met蛋白在鼻咽癌活检组织中的阳性表达率明显高于鼻咽炎性组织,差异有极显著性（P<0.01）。c-Met的表达与鼻咽癌的临床分期、伴有淋巴结转移相关（P<0.05）；与年龄、性别、组织分型均无相关（P>0.05）。c-Met mRNA在鼻咽癌活检组织中的表达水平明显高于鼻咽炎性组织,差异有显著性（P<0.05）。结论：鼻咽癌组织中c-Met蛋白及mRNA水平均存在高表达,c-Met的高表达与其侵袭和转移有密切的关系,c-Met可作为鼻咽癌临床治疗及预后的参考指标。第二部分pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met真核表达质粒的构建及生物活性鉴定目的：设计以人c-Met基因为靶向的shRNA,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其抑制c-Met表达的效应,筛选RNA干扰作用最强的shRNA片段。方法：针对c-Met基因的mRNA序列设计3个干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个随机序列质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体介导的方法将其转染至鼻咽癌CNE-2细胞中,采用real-time PCR和western blot检测c-Met基因在mRNA和蛋白表达情况,比较转染前后其表达差异,判断各shRNA的干扰效应。结果：经测序证实,成功构建pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met真核表达质粒。重组质粒转染CNE-2细胞后,c-Met基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以2号重组质粒效应最强,mRNA水平下调90%,蛋白水平下调75%。结论：成功构建了针对c-Met基因的RNAi重组质粒,为下一步研究c-Met基因对鼻咽癌CNE-2细胞生物学行为的功能奠定了基础.第三部分沉默c-Met基因对鼻咽癌细胞生物学行为作用的研究目的：探讨c-Met shRNA真核表达载体对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、侵袭、转移及凋亡作用的影响。方法：建立转染pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met真核表达质粒和随机序列对照质粒的稳定单克隆细胞,分别采用CCK-8、基质胶粘附实验、体外迁移实验、transwell体外侵袭实验、流式细胞仪检测转染前后细胞增殖能力、细胞粘附率、细胞运动能力、细胞侵袭能力及细胞凋亡率的变化。结果：c-Met表达下调后,CNE-2细胞的增殖能力、细胞对基质胶的粘附率明显降低（P<0.05）,CNE-2细胞的体外迁移能力、侵袭能力明显降低（P<0.01）,CNE-2细胞凋亡率增加（P<0.05）。结论：原癌基因c-Met明显地促进了鼻咽癌CNE-2细胞株的体外增殖、粘附、迁移和侵袭能力,抑制了鼻咽癌CNE-2细胞的凋亡。提示c-Met在鼻咽癌的恶性进展中起重要作用,是一个潜在的鼻咽癌治疗靶点。第四部分沉默c-Met基因对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的影响目的：探讨c-Met shRNA真核表达载体对人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法：建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,观察c-Met shRNA真核表达载体的抗瘤疗效,分别在CNE-2细胞形成的移植瘤的体部和基底部多点微量注射c-Met shRNA真核表达载体质粒,注射等体积的随机质粒载体和生理盐水作为对照组,记录肿瘤体积的增长曲线,并在4周后处死裸鼠,取出移植瘤,用Western Blot及TUNEL分别检测移植瘤中原癌基因c-Met蛋白的表达水平和肿瘤细胞原位凋亡率。结果：36只裸鼠无一死亡,体重均匀增加,成瘤率100%。在注射组中,c-Met shRNA真核表达载体组的肿瘤体积的增长均比相应的注射随机质粒载体和生理盐水组要慢。取出的移植瘤中c-Met蛋白的表达和原位TUNEL检测结果提示：移植瘤中相对于生理盐水对照组和随机质粒对照组,c-Met shRNA真核表达载组c-Met蛋白表达明显下降（P<0.05）；移植瘤中与生理盐水对照组和随机质粒对照组的凋亡率比较,c-Met shRNA真核表达载组凋亡率升高（P<0.05）。结论：c-Met shRNA真核表达载体明显抑制人鼻咽癌CNE-2细胞移植裸鼠成瘤后的生长,shRNA真核表达载体介导的基因治疗有希望成为鼻咽癌靶向性c-Met治疗的新策略。
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