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烟草吸钾相关基因克隆与表达调控研究

2020-11-28阅读(710)

烟草吸钾相关基因克隆与表达调控研究

论文摘要

烟草钾素营养不但在烟叶生长、发育过程中影响烟叶的抗病性、抗逆性和适烤性,直接影响烟叶的香气质、香气量和燃烧性,还与烟气中焦油、苯并芘等有害物质含量有着密切的相关性,烟叶含钾量是烟叶重要的品质指标。调查表明我国烟叶含钾量显著低于美国、津巴布韦和巴西等国际优质烟叶,多年来,学者们曾尝试从增加钾肥施用量、改善施肥方法等方面提高烟叶含钾量,但收效甚微,烟叶含钾量过低一直是困扰我国烟区的重大技术难题。本研究克隆了拟南芥钾离子转运蛋白基因AtKup1、Na+/H+反向转运体基因AtNHX1和无机焦磷酸酶基因AVP2,分别构建高效植物表达载体,通过根癌农杆菌介导法转化烟草,分析了3类基因转化烟草幼根中5种内源吸钾相关基因（烟草钾通道、K+转运蛋白、无机焦磷酸酶、细胞膜H+泵和液泡膜H+泵）转录水平,结果表明:在转AtKup1基因烟草幼根中,烟草K+转运蛋白基因NtHAK1转录显著降低,细胞膜H+-ATPase基因显著增加,其它基因转录没有显著变化;在过量表达AtNHX1基因的烟草幼根中,烟草钾离子转运蛋白基因NtHAK1的转录水平显著降低,H+-ATPase基因NHA1和VAG1显著增加;而焦磷酸酶基因NVP1的转录稍有增加,钾通道基因NKT1转录变化不大;过量表达AVP2基因使烟草幼根中的烟草液泡膜H+-ATPase基因VAG1和液泡膜H+-PPase基因NVP1的转录水平降低,K+转运体基因NtHAK1基因显著增加,而钾通道基因NKT1稍有增加,细胞质膜H+-ATPase基因NHA1无显著变化。烟叶内在化学成分分析结果表明:三种基因的过量表达均可不同程度地增强烟株根系的吸钾能力,提高烟叶含钾量。为增强外源吸钾基因的表达活性,本研究采用DNA改组方法进行AtKup1基因的体外分子进化,建立AtKup1基因突变库,筛选吸钾活性增强的AtKup1基因的突变型,并导入烟草进行表达分析,获得吸钾能力显著提高的转化材料。通过对拟南芥等不同物种间的K+转运蛋白基因KT/KUP/HAK、钾通道基因、质子泵（H+-ATPase）基因和H+转运无机焦磷酸酶基因的同源性比对分析,采用兼并引物PCR扩增和RACE方法分别获得了烟草4个吸钾相关基因的cDNA全序列（NrHAK1, NKC1, NVP1和NtHAK1）,并将所获得的NrHAK1基因导入酿酒酵母钾吸收缺陷型菌株进行功能性研究,结果发现:NrHAK1基因可以使酵母钾吸收缺陷型菌株恢复吸钾能力。烟草不同组织的转录水平分析发现:NrHAK1基因在烟苗幼根转录量最大,证实该基因与烟草根系吸钾有关。应用荧光定量PCR原理,通过优化引物设计、qRT-PCR反应体系和反应条件,选择适宜的看家基因,建立了适于植物分子营养研究的mRNA定量方法,并利用这一方法研究了K+、Ca2+无机营养缺乏和Na+、NH4+高盐胁迫条件下,烟草K+通道基因NKT1、K+转运蛋白基因NtHAK1、无机焦磷酸酶基因NVP1、细胞质膜质子泵基因NHA1和液泡膜质子泵基因VAG1的转录水平。结果表明:K+饥饿条件下,K+转运蛋白基因NtHAK1基因转录量增加, V-PPase基因NVP1的转录降低;在缺钙条件下,钾通道基因NKT1、烟草K+转运蛋白基NtHAK1,编码P-ATPase的G亚基VAG1基因和V-ATPase的NHA1基因转录显著下降;在高浓度Na+胁迫条件下,植物根系钾离子转运蛋白基因NtHAK1、质膜质子泵P-H+-ATPase基因NHA1和液泡膜质子泵V-H+-ATPase基因VAG1转录显著增加,钾通道基因NKT1降低。试验还发现环境中高浓度的NH4+使钾离子转运蛋白基因显著降低,V-ATPase基因NHA1和V-PPase基因NVP1均有所增加。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 烟叶含钾量现状
  • 1.2 植物钾素营养吸收生理的研究状况
  • 1.2.1 植物钾素吸收机制
  • 1.2.2 植物钾素吸收与能量供应
  • +通道'>1.2.3 K+通道
  • 1.2.4 HKT/TRK 基因
  • 1.2.5 KT/HAK/KUP
  • +/H+-ATPase'>1.2.6 Na+/H+-ATPase
  • 1.2.7 液泡无机焦磷酸酶
  • +-ATPase'>1.2.8 H+-ATPase
  • 1.3 吸钾相关基因的表达与调控
  • 1.4 课题来源、研究内容及研究目的和意义
  • 1.4.1 课题来源
  • 1.4.2 课题研究目的
  • 1.4.3 课题研究的意义
  • 1.4.4 主要研究内容
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 拟南芥吸钾相关基因的克隆与烟草表达
  • 2.1.1 拟南芥吸钾相关基因的克隆
  • +转运基因TRK1 和 TRK2 的敲除'>2.1.2 酿酒酵母K+转运基因TRK1 和 TRK2 的敲除
  • 2.1.3 AtKUP1 基因改组
  • 2.1.4 植物表达载体的构建
  • 2.1.5 烟草转化
  • 2.1.6 转化子的分子鉴定
  • 2.1.7 烟叶含钾量的测定
  • 2.2 黄花烟草吸钾相关基因的克隆与功能分析
  • 2.2.1 吸钾相关基因的克隆
  • 2.2.2 烟草吸钾相关基因的序列分析
  • 2.2.3 NrHAK1 基因的酵母表达
  • 2.2.4 黄花烟草 NrHAK1 转录分析
  • 2.3 烟草吸钾基因转录分析
  • 2.3.1 植物营养相关基因转录分析方法优化
  • 2.3.2 烟草培养与盐胁迫处理
  • 2.3.3 Northern 杂交
  • 2.3.4 荧光定量 PCR 检测
  • 第3章 拟南芥吸钾基因克隆与烟草转化
  • 3.1 拟南芥AtKUP1 基因的克隆与烟草转化
  • 3.1.1 拟南芥 AtKUP1 基因的克隆
  • 3.1.2 构建 AtKUP1 基因的植物表达载体
  • 3.1.3 转化子的GUS 染色鉴定
  • 3.1.4 转化子的PCR 鉴定
  • 3.1.5 转化子的Southern 杂交鉴定
  • 3.1.6 转化材料中AtKup1 基因的转录水平
  • 3.1.7 转化子烟草内源吸钾相关基因的转录
  • 3.1.8 转化材料烟叶主要化学成分
  • 3.2 拟南芥 AtNHX1 基因克隆与烟草转化
  • 3.2.1 AtNHX1 基因的克隆
  • 3.2.2 AtNHX1 基因内部Sac I 酶切位点的消除
  • 3.2.3 AtNHX1 基因的植物表达双元载体的构建
  • 3.2.4 转基因烟草的GUS 染色鉴定
  • 3.2.5 AtNHX1 转基因烟草的PCR 鉴定
  • 3.2.6 转化材料中AtNHX1 基因的转录水平
  • + 吸收相关基因的转录分析'>3.2.7 烟草K+吸收相关基因的转录分析
  • 3.2.8 各AtNHX1 烟草转化子烟叶内在化学成分
  • 3.3 拟南芥AVP2 基因的克隆与烟草转化
  • 3.3.1 拟南芥AVP2 基因的克隆
  • 3.3.2 AVP2 基因植物表达载体的构建
  • 3.3.3 AVP2 转化烟草的分子鉴定
  • 3.3.4 转化材料中AVP2 基因的转录水平
  • + 吸收相关基因的转录分析'>3.3.5 烟草K+吸收相关基因的转录分析
  • 3.3.6 转化材料烟叶含钾量的化验分析
  • 3.4 关于拟南芥吸钾基因烟草转化与表达的讨论
  • 3.5 本章小结
  • +转运蛋白AtKup1 基因DNA改组'>第4章 拟南芥K+转运蛋白AtKup1 基因DNA改组
  • 4.1 拟南芥AtKUP1 基因的克隆
  • 4.2 酿酒酵母钾素营养缺陷型
  • 4.2.1 URA3 基因同源重组转化
  • 4.2.2 HIS3 基因同源重组转化
  • 4.2.3 缺陷型菌株的培养特性
  • +载体基因功能'>4.2.4 功能互补鉴定拟南芥K+载体基因功能
  • +转运蛋白AtKup1 基因DNA改组'>4.3 拟南芥K+转运蛋白AtKup1 基因DNA改组
  • 4.3.1 高活性Atkup1 基因的筛选
  • 4.3.2 AtKUP1 突变基因的功能鉴定
  • 4.3.3 AtKUP1 突变基因的核苷酸序列测定
  • 4.4 AtKUP1 突变基因的烟草转化
  • 4.5 转化材料中AtKUP1 基因的转录分析
  • 4.6 转化材料中烟叶含钾量的化验分析
  • 4.7 关于DNA 分子进化和基因敲除技术的讨论
  • 4.8 本章小结
  • 第5章 烟草吸钾基因的克隆和功能性研究
  • 5.1 NrHAK1 的克隆与功能性研究
  • 5.1.1 NrHAK1 的克隆
  • 5.1.2 NrHAK1 蛋白氨基酸序列分析
  • 5.1.3 NrHAK1膜蛋白疏水区预测
  • 5.1.4 NrHAK1膜蛋白的进化树分析
  • 5.1.5 NrHAK1 在酵母缺陷型的功能补偿
  • 5.1.6 NrHAK1 基因的特异性表达
  • 5.1.7 无机盐分与NrHAK1 的转录调控
  • 5.2 黄花烟草钾通道基因 NKC1 的克隆与序列分析
  • 5.2.1 NKC1 的克隆
  • 5.2.2 NKC1 蛋白的分子量和氨基酸组成
  • 5.2.3 钾通道蛋白 NKC1 进化树分析
  • 5.2.4 NKC1 二级结构及疏水区预测
  • 5.2.5 黄花烟草钾通道蛋白NKC1 三维结构预测
  • 5.3 关于烟草吸钾基因克隆与功能研究的讨论
  • 5.4 本章小节
  • 第6章 烟草吸钾相关基因的转录分析
  • 6.1 吸钾基因转录分析方法的优化
  • 6.1.1 荧光定量 PCR 体系的优化
  • 6.1.2 qRT-PCR 扩增条件的优化
  • 6.1.3 看家基因的选择
  • 6.1.4 标准模板
  • 6.1.5 qRT-PCR 对基因转录水平的评价
  • 6.2 盐胁迫对吸钾基因转录的影响
  • 6.2.1 钾通道基因的转录
  • 6.2.2 钾离子转运体基因的转录
  • 6.2.3 质子泵基因的转录
  • +吸收相关基因的转录影响因子的讨论'>6.3 关于K+吸收相关基因的转录影响因子的讨论
  • 6.4 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢
  • 个人简历
  • 符号及缩略词说明

    • 相关论文文献

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