河豚毒素（TTX）的一般毒理学研究

论文摘要

1909年,日本学者田原良纯从豚属鱼卵内提取到一种粗品毒素,命名为河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)。1950年横尾晃获得了TTX结晶状物质,证实其是一种毒性极高、相对分子质量小的非蛋白毒素,其结构为一种笼形原酸酯类[1]。从50年代起,国外学者对TTX进行了一系列药理和临床应用的研究工作,1972年Kishi[2]等采用化学方法合成了TTX,但迄今为止,TTX的主要来源仍然是东方豚属(Fugu)的河豚。鉴于这种非蛋白毒素具有对神经的选择性作用,多年来一直作为工具药广泛地用于生理学和药理学研究[3～5]。近年来,更多的科研人员将注意力放在了TTX临床应用价值上,希望能将其开发成具有良好的抗心律失常、镇静、止痛、解痉等药理作用的生物药品。最近,人们又拟将其开发成具有良好市场前景的戒毒药。本课题旨在研究TTX拟开发为戒毒药(肌注给药,10μg/人/次,一天一次,疗程7~12天。)的前提下,遵循国内相关的临床前安全性评价指导原则,进行TTX的一般毒理学研究,为其临床试验剂量设计和主要观察指标提供依据。本课题采用药物临床前安全性研究中公认的标准研究动物Wistar大鼠、SD大鼠以及恒河猴,分别进行急性毒性试验和长期毒性试验,观察试验动物的一般生理指标,检验血液学、血液生化、尿液化学及尿沉渣等指标,并对所有试验动物在给药结束和恢复期结束后进行病理组织学检查。同时观察在本试验条件下,TTX对试验动物是否具有刺激性和溶血性反应。Wistar大鼠肌肉单次注射TTX结果表明,给药后,动物局部注射部位出现活动障碍,随剂量增加出现麻痹、肌无力症状。另外,随剂量增加,大鼠依次出现全身中毒症状,表现为:精神萎靡、全身肌无力、腹式呼吸、呼吸困难、抽搐、死亡。结果提示TTX的急性毒性主要表现为中枢神经系统(包括呼吸中枢和运动中枢)抑制和局部和全身的神经肌肉传导阻滞。未死亡动物在给药7小时后基本恢复正常。连续观察2周未见动物异常表现。期间无动物再出现死亡。至观察期结束时,各组存活动物体重比较未见显著差异。试验结束时处死动物大体解剖未见异常。采用bliss法计算Wistar雄性和雌性大鼠单次肌肉注射TTX的LD50分别为10.53μg/kg和11.75μg/kg(95%可信区间分别为9.99～11.10μg/kg和10.91～12.65μg/kg)。Wistar大鼠单次静脉注射TTX给药后,动物出现活动减少、精神萎靡、肌张力降低症状,且症状随剂量增加而加重,甚至出现腹式呼吸、呼吸困难、抽搐、死亡。结果提示静脉注射TTX的急性毒性主要表现为中枢神经系统(包括呼吸中枢和运动中枢)抑制。未死亡动物在给药7小时后基本恢复正常。连续观察2周未见动物异常表现,各组动物未见毒理学意义的差异。期间无动物再出现死亡,试验结束时处死动物大体解剖未见异常。采用bliss法计算Wistar雄性和雌性大鼠单次静脉注射TTX的LD50分别为8.54μg/kg和10.10μg/kg(95%可信限分别为8.10～9.00μg/kg和9.37～10.90μg/kg)。结合大鼠肌肉注射TTX急性毒性试验结果,初步推算Wistar雄性和雌性大鼠肌肉注射TTX的生物利用度为81.1%和86.0%。大鼠肌肉注射TTX重复给药1个月试验中,设TTX 1.5,3,6μg/kg 3个剂量组,另设赋形剂对照组和空白对照组。每组选用SPF级SD大鼠20只,雌雄各半。每天肌肉注射给药一次,连续30个给药日,两后肢轮流注射,并设30天恢复期。每天记录实验动物一般临床表现,定期称重并检测摄食量;给药期结束和恢复期结束时进行半数动物的血液生化、眼科和组织病理学检查,剩余动物30天恢复期后进行同样的指标检查。临床观察发现,3、6μg/kg组动物肌肉注射TTX后出现注射后肢运动障碍、麻痹、肌无力的症状,另外还出现活动减少、精神萎靡和困倦以及全身的肌无力等中枢抑制症状,上述表现随给药时间的延长而缓慢加重,在次日给药前基本能够恢复;另外,随剂量的增加,大鼠的毛色变差,高剂量组五只大鼠(4雌、1雄)出现背部、尾部的片状或/和斑点状明显脱毛现象,至处死时未见明显好转。停止给药后连续观察30天未见异常;给药期和恢复期间,动物其他临床观察,如腺体分泌、粪便性状、粘膜等未见异常。从检疫期、给药期到恢复期结束,各处理组动物体重与同期对照组相比未见毒理学意义的差异,摄食量未见有毒理学意义的改变。各组动物眼科检查正常。所检测14项血液学指标和15项血液生化指标均在正常参考值范围波动。病理大体解剖未发现脏器特异性变化,镜检也没有发现受检脏器与给药相关的病理形态改变。停止给药后连续观察一个月未见动物有其它延迟性毒性。本实验条件下,未见与全身和局部刺激相关的临床症状,血液学、血液生化检查及脾脏重量未见异常,注射部位未见局部刺激反应,因此认为TTX无局部刺激性及溶血性。在本试验条件下,大鼠肌肉注射TTX重复给药的无明显毒性反应剂量为1.5μg/kg,TTX对SD大鼠的毒性反应主要表现为局部和全身的神经肌肉传导阻滞以及中枢神经系统抑制,无局部刺激性及溶血性反应。恒河猴肌肉单次注射TTX的试验中,5.000μg/kg剂量受试动物死亡,4.375μg/kg、3.750μg/kg、2.500μg/kg剂量受试动物均存活。5.000μg/kg剂量动物给药6分钟后排便,给药14分钟开始表现肌无力;16分钟时不能站立,瘫痪,少量流涎,呕吐症状;23分钟时脉搏迟缓,处于濒死期;给药28分钟后死亡,大体解剖未见异常。4.375μg/kg剂量动物给药19分钟后肢表现肌无力症状;27分钟站立姿势不稳;34分钟时无法站立,上肢略显无力,50分钟四肢无力更加明显,55分钟表现全身无力、头下垂;给药1.5小时上肢力量逐渐恢复,下肢仍不能站立; 4.5小时后下肢力量有所恢复;6.5小时下肢力量完全恢复。3.750μg/kg剂量动物给药48分钟后肢开始表现肌无力症状,无法行走,前肢症状不明显,4小时后后肢恢复正常。2.500μg/kg组动物给药后未见异常。所有存活动物连续观察2周均未见异常,试验结束时处死动物大体解剖未见异常。综上所述,在本实验条件下,单次肌肉注射TTX对雄性恒河猴的近似致死剂量范围为5.000μg/kg~4.375μg/kg、最高非致死剂量为4.375μg/kg和最大无毒反应剂量为2.500μg/kg。恒河猴肌肉注射TTX反复给药1个月毒性试验中,在给药第一周高剂量组均表现为呕吐,呕吐发生在给药后30分钟左右,给药一周后症状消失。动物粪便性状、粘膜等未见异常。体温、心电图和眼科检查未见有毒理学意义的改变。所检测14项血液学指标和17项血液生化指标均在正常参考值范围波动。各组动物从检疫期、给药期到恢复期结束体重增长未见有毒理学意义的变化。给药后各组动物食量与同期空白对照组相比未见明显差异,恢复期各剂量组动物食量未见明显改变。病理检查没有发现毒作用靶器官,受检脏器也没有发现与给药相关的其他病理形态改变。停止给药后连续观察一个月未见动物有其他延迟性毒性。在本试验条件下,恒河猴肌肉注射TTX反复给药一个月的无毒性反应的剂量为1.50μg /kg,TTX对恒河猴的毒性反应表现为呕吐的胃肠道反应。综上,通过对TTX进行的临床前安全性评价研究,我们得知TTX对Wistar雄性和雌性大鼠单次肌肉注射TTX的LD50分别为10.53μg/kg和11.75μg/kg,对Wistar雄性和雌性大鼠单次静脉注射TTX的LD50分别为8.54μg/kg和10.10μg/kg,Wistar雄性和雌性大鼠肌肉注射TTX的生物利用度为81.1%和86.0%。SD大鼠肌肉注射TTX重复给药一个月的无明显毒性反应剂量为1.5μg/kg,TTX对SD大鼠的毒性反应主要表现为局部和全身的神经肌肉传导阻滞以及中枢神经系统抑制,无局部刺激性及溶血性反应。恒河猴单次肌肉注射TTX对雄性恒河猴的近似致死剂量范围为5.000μg/kg~4.375μg/kg、最高非致死剂量为4.375μg/kg和最大无毒反应剂量为2.500μg/kg,恒河猴肌肉注射TTX反复给药一个月的无毒性反应的剂量为1.50μg /kg,TTX对恒河猴的毒性反应表现为呕吐的胃肠道反应。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 大鼠河豚毒素的一般毒性试验
• 第一节 大鼠急性毒性试验
• 第二节 大鼠长期毒性试验
• 第二章 恒河猴河豚毒素的一般毒性研究
• 第一节 恒河猴急性毒性试验
• 第二节 恒河猴长期毒性试验
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表及撰写的学术论文目录