GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPP）的原核表达与性质的表征

论文摘要

GDP-甘露糖是一种广泛存在于各种生物体内的糖基供体和代谢中间物，其在原核生物中主要参与O-抗原等寡糖的生物合成[1]；在真核生物中主要作为蛋白质糖基化的重要糖基供体和其他糖核苷酸生物合成的前体[2]；在某些植物中参与维生素C生物合成[3]。可见大量得到GDP-甘露糖的纯品可以为糖蛋白的生产、实验室研究提供必要的物质基础。然而在生物体内，GDP-甘露糖的含量普遍很低，通过对野生型生物材料分离纯化而得到GDP-甘露糖几乎不可能。如果能够高效表达GDP-甘露糖生物合成所需的酶系，并且对此酶系中各个酶的性质都有比较透彻的了解的话，我们则可以体外合成GDP-甘露糖。在大多数生物体中，GDP-甘露糖的生物合成途径如下[4]：由甘露糖起始，经己糖激酶催化生成甘露糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸在磷酸己糖异构酶的催化下生成甘露糖-1-磷酸，以甘露糖-1-磷酸和GDP（GTP）为底物在GDP-甘露糖焦磷酸化酶作用下最终合成GDP-甘露糖。其中，对己糖激酶和磷酸己糖异构酶的性质已经研究的相对比较透彻，并且有晶体结构的报道[5]，而对GDP-甘露糖焦磷酸化酶的研究相对较少，所以本实验原核表达了大肠杆菌来源的GDP-甘露糖焦磷酸化酶并做了比较详尽的酶动力学研究。按底物种类，我们能找到两种类型的GDP-甘露糖焦磷酸化酶：类型Ⅰ（EC2．7．7．13）利用GTP和甘露糖-1-磷酸为底物，类型Ⅱ（EC 2．7．7．22）则利用GDP和甘露糖-1-磷酸为底物。参照以往的报道[6，7]，E．coli K12来源的GDP-甘露糖焦磷酸化酶属于类型Ⅱ，我们通过PCR技术扩增得到了来源于E coli K12的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因cpsB，并定向克隆到原核表达载体pET-22b上，转化E coli BL21（DE3），发酵重组菌株至指数期，加入诱导物IPTG，使GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因得到高水平表达，超声破碎细胞，上清经Ni-NTAHis·Bind（?）Resins亲和层析纯化，最后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表达水平和纯度。带有His-tag的重组Cps B大小为52 kDa，在Tris-CI缓冲系统中，最适pH为7．5；Mg2+为该酶催化反应所必需。在最适反应条件下，以毛细管电泳检测GDP-甘露糖的生成量为指标，酶动力学分析表明Cps B既能够利用GDP，也能利用GTP，对于GDP，GTP，甘露糖-1-磷酸和GDP-甘露糖的Km分别为0．9896，0．06749，0．05124和0．0209 mM，Kcat/Km分别为1．04×104，1．09×106，1．68×105和4．69×106S-1mM-1。结合其他实验结果，最终首次提出了GDP-甘露糖焦磷酸化酶的完整的物质反应平衡。此研究不仅可以深入地了解GDP-甘露糖焦磷酸化酶催化机制，并最终为其蛋白晶体结构的解析提供必要的基本信息，还可以为GDP-甘露糖的体外合成提供重要的酶学理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 前言
• 1.1 糖研究综述
• 1.2 GDP-Man的发现及其生物学意义
• 1.3 GDP-Man代谢及其主要酶类
• 1.4 pET系列原核表达系统简介
• 1.5 本论文的研究目的和意义
• 第二部分 实验部分
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 目的基因序列
• 2.1.2 表达载体
• 2.1.3 宿主
• 2.1.4 试剂盒成品及各种酶试剂
• 2.1.5 琼脂糖凝胶电泳所用试剂
• 2.1.6 PCR所用试剂
• 2.1.7 制备感受态细胞所用试剂
• 2.1.8 培养基
• 2.1.9 提取目的蛋白所需溶液及亲和层析所需介质
• 2.1.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所需溶液
• 2.1.11 酶活测定各种缓冲液的配制
• 2.1.12 毛细管电泳条件
• 2.1.13 主要仪器
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 目的基因cpsB的获得
• 2.2.1.1 引物设计
• 2.2.1.2 提取E.coli K12基因组
• 2.2.1.3 PCR扩增基因cpsB
• 2.2.1.3.1 PCR反应体系
• 2.2.1.3.2 PCR反应程序设定
• 2.2.1.3.3 电泳检测PCR结果
• 2.2.1.4 cpsB基因的溶液回收纯化
• 2.2.2 pET-22b质粒载体的获得
• 2.2.2.1 提取质粒pET-22b
• 2.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.3 cpsB-pET-22b质粒载体的构建
• 2.2.3.1 cpsB基因双酶切反应
• 2.2.3.2 回收纯化基因
• 2.2.3.3 pET-22b质粒双酶切反应
• 2.2.3.4 凝胶回收pET-22b质粒双酶切后的大片段
• 2.2.3.5 pET-22b质粒片段和cpsB基因片段的连接反应
• 2.2.4 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.5 转化E.coli DH5α
• 2.2.6 全细胞PCR检测
• 2.2.6.1 反应体系
• 2.2.6.2 PCR反应程序设定
• 2.2.6.3 电泳检测PCR结果
• 2.2.7 测序以验证插入基因序列
• 2.2.8 重组蛋白Cps B的纯化与蛋白定量
• 2.2.8.1 E.coli BL21（DE3）的培养及蛋白质的诱导表达
• 2.2.8.2 提取E.coli BL21（DE3）表达的Cps B
• 2.2.8.3 Cps B的亲和层析纯化
• 2.2.8.4 Cps B的SDS-PAGE电泳检测
• 2.2.8.5 Cps B的脱盐与浓缩
• 2.2.8.6 Cps B浓度测定
• 2.2.9 酶动力学分析
• 2.2.9.1 标准品的CE检测
• 2.2.9.2 GDP-Man、GDP和GTP定量标准曲线
• 2.2.9.3 不同底物的反应
• 2.2.9.3.1 以GTP,Man-1-P为底物
• 2HPO₄为底物'>2.2.9.3.2 以GDP,Man-1-P,Na₂HPO₄为底物
• 4P₂O₇为底物'>2.2.9.3.3 以GDP-Man,Na₄P₂O₇为底物
• 2HPO₄为底物'>2.2.9.3.4 以GDP-Man,Na₂HPO₄为底物
• 2.2.10 反应体系的优化
• 2.2.10.1 缓冲体系pH的优化
• 2.2.10.2 金属离子种类的优化
• 2+浓度的优化'>2.2.10.3 Mg²⁺浓度的优化
• 2.2.11 动力学参数的测定
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 目的基因cpsB的获得
• 2.3.2 pET-22b质粒载体的获得
• 2.3.3 重组E.coli DH5α全细胞PCR检测
• 2.3.4 测序以验证插入基因序列
• 2.3.5 Cps B的亲和层析纯化及SDS-PAGE电泳检测
• 2.3.6 Cps B浓度测定
• 2.3.6.1 蛋白浓度定量标准曲线的绘制
• 2.3.6.2 Cps B浓度的计算
• 2.3.7 酶动力学分析
• 2.3.7.1 标准品的CE检测
• 2.3.7.2 GDP-Man、GDP和GTP定量标准曲线
• 2.3.7.2.1 GDP-Man定量标准曲线
• 2.3.7.2.2 GDP定量标准曲线
• 2.3.7.2.3 GTP定量标准曲线
• 2.3.7.3 不同底物的反应
• 2.3.7.3.1 以GTP,Man-1-P为底物
• 2HPO₄为底物'>2.3.7.3.2 以GDP,Man-1-P,Na₂HPO₄为底物
• 4P₂O₇为底物'>2.3.7.3.3 以GDP-Man,Na₄P₂O₇为底物
• 2HPO₄为底物'>2.3.7.3.4 以GDP-Man,Na₂HPO₄为底物
• 2.3.7.4 反应体系的优化
• 2.3.7.4.1 缓冲体系pH的优化
• 2.3.7.4.2 金属离子种类的优化
• 2+浓度的优化'>2.3.7.4.3 Mg²⁺浓度的优化
• 2.3.7.5 动力学参数的测定
• 第三部分 结论与展望
• 3.1 有关蛋白表达
• 3.2 有关反应物质平衡
• 3.3 有关酶动力学研究以及对其分类的讨论
• 3.4 对于体外合成GDP-Man的讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表