论文摘要
代谢综合征（metabolic syndrome, MS）是高血压、高血糖、血脂紊乱和肥胖等多种疾病在体内集结的一种状态,可直接引起2型糖尿病及心血管病变。宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation, IUGR）指胎儿出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的两个标准差,可造成胎儿窘迫、新生儿窒息和围产儿死亡,是围产儿发病和死亡的重要原因。IUGR在发展中国家发病率约24%,发达国家约2%。欧洲、北美及发展中国家流行病学调查均显示,低出生体重儿成年后发生胰岛素抵抗、糖尿病、高血压及缺血性心脏病的几率升高。研究表明,IUGR胎儿成年后MS发生率比正常胎儿高6倍（分别为2.3%和0.4%）。以上研究结果提示,MS存在宫内起源。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是MS在肝脏的特异表现,是以肝实质细胞脂肪性变和脂肪贮积为特征的临床病理综合症。近年来,随着人民生活水平的提高,我国NAFLD的发病率明显上升,已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。近来,IUGR被报道为NAFLD的重要危险因素。低出生体重儿童NAFLD的发生率是正常体重儿童的4倍。提示,NAFLD也存在宫内起源。胎儿发育编程改变是指胎儿在发育过程中,环境异常所致原本的发育过程的改变,会对机体的功能产生长期或永久的影响。IUGR与成年MS及NAFLD易感之间的机制尚不清楚,近期报道提示,宫内下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴的编程改变,可能是成年MS的宫内起源的潜在机制。孕期摄食限制所致的宫内营养不良模型,是较为常用的诱导实验动物IUGR发生的方式,能够模拟人体孕期疾病因素（如妊娠反应过重、胎盘功能异常）或社会环境（如饥荒）所致营养不良的宫内环境,可能对个体内分泌和代谢功能带来长期的影响。高脂饮食与成年高血压、糖耐量降低、胰岛素抵抗、2型糖尿病、血脂紊乱、肥胖和生殖障碍有关。本课题将观察孕期摄食限制对IUGR胎鼠HPA轴及糖脂代谢功能的影响；仔鼠出生后将采用高脂饮食模拟过营养环境,从而诱导成年MS及相关代谢性疾病,并观察成年仔鼠HPA轴基础活性和应激反应敏感性（采用不可预见慢性刺激模拟应激反应）,及相应状态下糖脂代谢的改变；在此基础上进一步观察肝脏局部代谢性疾病（如NAFLD）的发生。第一部分孕期摄食限制所致IUGR胎鼠HPA轴活性改变目的：在孕期摄食限制所致IUGR胎鼠模型上,观察胎鼠HPA轴及高位调控器官海马的发育、活性及功能改变。方法：Wistar孕鼠自妊娠日（gestational day, GD）11起,对照组（control, CN）自由饮食,摄食限制（food restriction, FR）组每日给予CN组平均日摄食量的50%（预实验测得CN组日平均摄食量为60g/kg body weight）。GD20时孕鼠异氟醚麻醉后剖腹取胎。记录胎鼠体重和性别,计算IUGR胎鼠数量及其发生率。CN组保留正常体重胎鼠,FR组仅保留IUGR胎鼠。收集胎鼠血液,ELISA法检测大鼠血皮质酮（corticosterone, CORT）含量。分离胎鼠下丘脑和肾上腺进行实时定量PCR检测。分离胎鼠海马进行Genome Lab GexP多基因表达分析。结果：①体重、IUGR率及血CORT:与CN组相比,FR组雄鼠和雌鼠平均体重低于CN组（P<0.01,P<0.05）;IUGR率显著高于CN组（P<0.01）；FR组雄性和雌性胎鼠血清CORT浓度均显著高于CN组（P<0.05）。②HPA轴活性：与CN组相比,FR组胎鼠下丘脑促肾上腺皮质素释放激素（corticotrophin releasing hormone, CRH）表达无明显变化,但精氨酸加压素（arginine vasopressin, AVP）均显著降低（P<0.01）。FR组雄性胎鼠代表下丘脑兴奋性神经纤维数量的2型囊泡膜谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporter2, VGLUT2） mRNA表达显著升高（P<0.01）,而雌鼠无显著变化；代表抑制性神经纤维数量的谷氨酸脱羧酶65（glutamate decarboxylase65, GAD65）的mRNA表达在雄鼠升高（P<0.01）而在雌鼠降低（P<0.05）；FR组雄、雌性胎鼠VGluT2/GAD65表达比均显著升高（P<0.01）。FR组胎鼠兴奋性神经递质受体N-甲基-天冬氨酸受体（N-methyl-Daspartic acid receptor, NR）1和2B均显著降低（P<0.01,P<0.05）；FR组雄鼠抑制性神经递质受体γ氨基丁酸受体A亚型β1亚基（γ-aminobutyric acid A receptor subunit β1, GABAR-Aβ1）表达升高（P<0.01）,雌鼠无差异,而GABAR-Aβ2表达在雄鼠无明显差异,雌鼠表达降低（P<0.05）。FR组胎鼠肾上腺甾体激素急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein, StAR）有降低趋势,细胞色素P450侧链裂解酶（P450cholesterol side chain cleavage, P450scc）无明显变化；FR组胎鼠肾上腺的胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor1receptor, IGF1R）和蛋白激酶B1（protien kinase B, Akt1/PKB1）的表达均显著降低（P<0.01）。③海马活性相关基因表达变化：与CN组胎鼠海马相比,FR组胎鼠盐皮质激素受体（MR）和糖皮质激素受体（GR）表达无明显变化；与海马神经元信息功能传递密切相关的脑源性神经营养因子（BDNF）显著降低（P<0.05）,可影响BDNF表达的环磷腺苷应答元件结合蛋白（CREB）和BDNF受体原肌球蛋白受体激酶（TrkB）表达未发生明显变化；学习、记忆功能相关的NR2B、突触蛋白（Syn1）和突触小体相关蛋白25（SNAP25）表达显著降低（P<0.05）,而NR2A、谷氨酸受体2（GluR2）和超极化激活环化核苷酸门控通道1（HCN1）无明显改变；神经细胞骨架形成和细胞增殖相关基因中,细胞周期依赖性激酶（CDK2）的表达升高（P<0.05）,但细胞分裂调控蛋白42（Cdc42）、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1）、Ras基因家族成员A （RhoA）、细胞周期蛋白（CyclinA）没有明显变化；抑制凋亡的基因B-细胞淋巴瘤2（Bcl-2）表达无显著改变,但促进凋亡的基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8（Caspase8）表达显著升高（P<0.05）。结论：孕期摄食限制引起胎盘GC屏障打开,胎儿暴露于高浓度母源性GC,致使胎海马神经元损伤、HPA轴抑制但下丘脑兴奋性潜能增加。第二部分孕期摄食限制所致IUGR胎鼠糖脂代谢改变目的：在孕期摄食限制所致IUGR胎鼠模型上,观察胎鼠外周血表型和肝脏糖脂代谢功能改变。方法：孕鼠及其GD20胎鼠的处理方式同第一部分。收集胎鼠血液后,ELISA法检测大鼠IGF1含量；放免法测定血清胰岛素含量；生化方法检测血清葡萄糖、甘油三酯（triglyceride, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TCH）、低密度脂蛋白-胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C）及高密度脂蛋白-胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C）含量。分离胎鼠肝脏,一部分用于苏木素伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色和电镜观察；另一部分用于Genome Lab GexP多基因表达分析。结果：①肝脏形态学：FR胎鼠肝脏实质细胞空泡增多但胞浆减少；CN组胎鼠肝脏线粒体嵴结构清晰,然而FR胎鼠肝脏线粒体肿胀变形,肝脏实质细胞胞浆中发现大量糖原颗粒堆积。②血清糖、脂代谢水平：与CN组相比,FR胎鼠血糖和血胰岛素有升高趋势,血清胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor1, IGF1）浓度显著降低（P<0.05）。血TG、TCH和HDL-C浓度亦有升高趋势,而雌性FR胎鼠血LDL-C浓度降低（P<0.05）。③肝脏糖脂代谢相关基因表达：与CN组相比,胎鼠肝脏IGF1通路相关基因中,FR组雄鼠和雌鼠IGF1表达均显著降低（P<0.01或P<0.05）,胰岛素受体底物（IRS）1表达在雄鼠有降低趋势,雌鼠降低（P<0.05）；FR雄鼠和雌鼠胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）、胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）、胰岛素受体（INSR）以及IRS2基因表达无统计学差异。FR组雄鼠和雌鼠的影响糖原合成的基因糖原合成酶激酶3β（GSK3β）无明显变化,糖异生关键酶葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）表达在雄鼠无明显变化,雌鼠显著升高（P<0.05）,转录因子叉头转录因子OI（FOXOI）在FR雄鼠表达有下降趋势,雌鼠显著下调（P<0.05）。肝脏脂联素／瘦素信号通路相关基因,FR组雄鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）表达显著升高（P<0.05）,FR组雄性和雌性胎鼠脂联素受体2（AdipoR2）、瘦素受体（LEPR）、Janus激酶（JAK）2、腺苷单磷酸激活蛋白激酶a（AMPKa）以及雌性的mTORC2表达均无统计学差异。促脂肪合成的关键酶或蛋白中,脂肪酸合酶（FASN）和甾体调节元件结合蛋白lc（SREBPlc）表达在FR雄鼠显著上调（P<0.05）,雌鼠无显著变化,FR组雄性和雌性胎鼠的乙酰辅酶A羧化酶α（ACCa）和甲基戊二酸乙酰辅酶A还原酶（HMGCR）表达无统计学差异,但ACCa表达有升高趋势。脂肪酸β氧化的限速酶肉毒碱棕榈酰转移酶-1a（CPT1α）表达在FR雄鼠显著下调（P<0.05）,雌鼠有下降趋势。促进肝脏脂质输出的蛋白微粒体甘油三酯转移蛋白（MTTP）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARa）表达均下调（P<0.05）,APOB表达雄鼠下调（P<0.05）,雌鼠无差异。肝脏发育相关的肝细胞核因子4（HNF4）表达显著上调（P<0.01或P<0.05）。结论：孕期摄食限制所致的胎儿高血GC浓度引起胎血IGF1浓度下降,胎肝糖脂代谢功能的改变,即糖异生增加、脂质合成增强、脂质输出和氧化减少。第三部分孕期摄食限制IUGR子代存在HPA轴相关神经内分泌代谢编程改变目的：在孕期摄食限制所致IUGR仔鼠出生后高脂饮食饲养的模型上,观察成年仔鼠的HPA轴在基础和应激（慢性不可预见刺激）状态下的功能改变,以及伴随的外周糖脂代谢改变。方法：Wistar孕鼠自GD11起CN组自由饮食,FR组每日给予CN组平均日摄食量的50%。自然生产后,所有母鼠及其仔鼠自由饮食。出生后天数（postnatal day, PD）为1天时,每窝仔鼠随机调整为8只并尽量平衡性别比例为l：1。出生后周数（postnatal week, PW）为4周时,每窝随机挑选1只雄鼠和雌鼠组成CN组和FR组,每组8只雄鼠或雌鼠,此时仔鼠断奶,雌雄分笼,所有仔鼠均给予含89.5%玉米粉、10%猪油和0.5%胆固醇的高脂饮食至处死。仔鼠出生后每周称重。PW16时,CN和FR组所有仔鼠禁食12h后行口服糖耐量实验（oral glucose tolerance test, OGTT）, OGTT的0min血清同时还用于检测血清促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone, ACTH）)、 CORT、葡萄糖、胰岛素、TG和TCH。PW17时,CN和FR组所有仔鼠给予慢性不可预见刺激（unpredictable chronic stress, UCS）,其过程持续3周。PW20时禁食12h后,所有大鼠再次行OGTT实验,OGTT的0min血清同样用于检测血清ACTH、CORT、葡萄糖、胰岛素、TG和TCH。1h后大鼠异氟醚麻醉处死,快速分离海马、下丘脑、肾上腺和肝脏组织。每组随机挑选3只迅速移除下丘脑、垂体、肝脏和胰腺,4%多聚甲醛固定用于组织学检测。结果：①体重及血清：与CN组相比,FR组大鼠PW1体重降低（P<0.01或P<0.05）；断奶前,FR组体重始终持续低于CN组（P<0.01或P<0.05）；断奶后雄鼠于PW9,雌鼠于PW4时,FR体重与CN组体重之间的差异消失；UCS后,FR组雌性体重升高（P<0.05）,雄鼠体重无明显改变。②海马调控功能：与CN组相比,UCS后,FR组大鼠海马1型-11p-羟类固醇脱氢酶（11P-hydroxysteroid dehydrogenase type-1,11β-HSD-1）、GR及MR表达均显著性升高（P<0.05或P<0.01）,MR/GR比值有降低趋势。③HPA轴活性变化：与CN组相比,UCS前,FR组大鼠下丘脑CRH的表达降低（P<0.05）；UCS后,FR组雄鼠CRH表达增加（P<0.05）,雌鼠无明显变化,但AVP表达均显著增加（P<0.01）。UCS前,FR组大鼠血ACTH浓度降低（P<0.01）,血CORT表现为雄鼠无差异,雌鼠升高（P<0.01）；UCS后,FR组雄鼠的血清ACTH、雄鼠和雌鼠的血清CORT浓度均显著升高（P<0.01）。FR组大鼠下丘脑MR表达无明显变化,但GR表达在雄鼠显著升高（P<0.05）,MR/GR比值降低（P<0.05）,FR雌鼠GR表达和MR/GR比值无明显变化。FR组大鼠肾上腺StAR和P450scc表达显著升高（P<0.01）。④UCS前、后血糖代谢表型变化：与CN组相比,FR组空腹血糖浓度UCS前无明显变化,UCS后升高（P<0.01）。UCS前,FR组空腹血胰岛素浓度表现为雄鼠显著降低（P<0.05）,雌鼠无差异；UCS后,FR组血胰岛素浓度均降低（P<0.05）。FR组大鼠OGTT血糖曲线UCS前没有明显差异;UCS后血糖代谢加快（P<0.01或P<0.05）；OGTT血胰岛素曲线UCS前变化不明显,UCS后呈释放不足（P<0.01或P<0.05）。⑤UCS前、后血脂代谢表型变化：与CN组相比,FR组大鼠TG和TCH浓度在雄鼠UCS前呈升高或有升高趋势（P<0.05）,UCS后降至CN组的浓度水平；雌鼠UCS前无明显差异,UCS后有升高趋势。UCS后FR组雄鼠]HDL-C和LDL-C有升高趋势,LDL-C/HDL-C比无明显变化；而FR组雌鼠]HDL-C有降低趋势,LDL-C显著降低（P<0.01）, LDL-C/HDL-C比显著降低（P<0.05）。⑥UCS后下丘脑、垂体、肝脏和胰腺的形态学：CN组大鼠下丘脑、垂体、肝脏和胰腺组织细胞形态和结构较为正常； FR组大鼠下丘脑、垂体、肝脏和胰腺组织细胞中发现大量脂滴,特别是雌性大鼠。结论：FR组子代出生后高脂饮食饲养下出现性别差异的追赶性生长,且成年后存在“HPA轴相关神经内分泌编程改变”现象：即HPA轴低基础活性和高应激敏感性,并伴随外周糖脂代谢改变及中枢、外周主要脏器的脂肪变性。HPA轴功能异常源于宫内,即宫内摄食限制导致海马和HPA轴发育编程改变,从而对HPA轴的负反馈调控异常。第四部分孕期摄食限制IUGR子代高脂饮食下成年后脂肪肝易感性增加目的：在孕期摄食限制所致IUGR仔鼠出生后高脂饮食饲养的模型上,观察成年仔鼠的NAFLD易感现象,并探讨其机制。方法：孕鼠及仔鼠的处理方式同第三部分,断奶后高脂饮食喂养且无其他处理后,PW23时检测肛温并检测24h摄食量。PW24时12h禁食后,大鼠异氟醚麻醉处死。收集血液分离得到血清检测CORT、IGF1、血糖、血胰岛素、TG和TCH。快速移除肝脏,每组随机挑选5只大鼠的同一部分肝脏4%多聚甲醛固定用于组织学检测。检测肝脏IGF1通路相关基因IGF1、IGF1R、IRS2和GLUT2,以及糖脂代谢相关基因G6Pase、SREBP1c、 MTTP、CPT1a的mRNA表达。结果：①体重、摄食量和肛温：与CN组相比,FR组仔鼠PW1体重显著降低（P<0.01）。FR组大鼠出生后体重持续低于CN组（P<0.01,P<0.05）,雄鼠PW12和雌鼠PW8时平均体重与CN组的差异消失。FR组肛温升高（P<0.01,P<0.05）,但摄食量不变甚至降低（P<0.01）。②血激素及糖脂代谢浓度：与CN组相比,FR组大鼠血清CORT浓度均显著降低（P<0.01）,而血清IGF1浓度均显著升高（P<0.01）。FR组血糖无明显差异,但FR组雌鼠血清TG浓度升高（P<0.05）。③肝脏形态学：CN组肝脏存在散在肝细胞小空泡状脂肪变性,FR组大鼠肝细胞则存在大量大空泡状脂肪变性。同时,FR组的平均Kleiner分值超过3,雌鼠Kleiner分值高于CN组（P<0.01）,雄鼠有升高趋势。④肝脏IGF1通路相关基因表达：与CN组相比,FR组大鼠肝脏IGF1、IGF1R及雄鼠GLUT2的mRNA表达均升高（P<0.01或P<0.05）,IRS2和雌鼠GLUT2的mRNA表达也有明显的升高趋势。⑤肝脏糖脂代谢相关基因表达：与CN组相比,FR组雌鼠肝脏G6Pase表达升高（P<0.01）,雄鼠有升高趋势；SREBP1c在FR雌性肝脏表达显著升高（P<0.05）,雄鼠差异不显著；脂质输出关键转运蛋白MTTP在FR雌性肝脏中的表达降低（P<0.01）；FR组雄鼠脂肪酸β氧化限速载体CPTla显著下调（P<0.01）,雌鼠也有降低趋势。结论：孕期摄食限制IUGR仔鼠出生后高脂饮食下出现追赶式生长,成年仔鼠发现处于高代谢状态、低CORT和高IGF1水平,伴随肝脏糖脂代谢紊乱（糖异生增加、脂质合成增加、脂质输出减少和脂质p氧化减少）,并出现NAFLD。“二种编程”假说用于解释孕期摄食限制IUGR子代NAFLD易感的宫内起源机制：第一种编程是不良宫内环境,诱导了胎肝糖脂代谢功能的编程改变,引起出生后NAFLD易感性增加;第二种编程是不良宫内环境所致胎儿GC-IGF1轴编程改变,引发子代出生后追赶式生长,会加快NAFLD的发生。