5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆表达及生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究

论文摘要

5-氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid,ALA）,是四吡咯类化合物(例如:亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B12)的共同前体,也是调节四吡咯类物质生物合成的关键代谢中间物,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来,发现ALA在农业上可用作杀虫剂、除草剂及生长调节因子;在医学领域,ALA作为第二代光动力药物,可用于治疗各种癌症,例如:皮肤癌、口腔癌、十二指肠癌、胰腺癌和膀胱癌等。因此对ALA的工业化生产引起了学术界和产业界的重视。 本文从微生物中克隆得到了ALA合成酶基因,构建了高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌,通过对工程菌培养条件的优化,大幅度提高了ALA的产量。 研究工作的主要创新点和进展包括: 1) 分别从放射形土壤杆菌（Agrobacterium bacterium zju-0121）和类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）细胞中克隆得到了5-氨基乙酰丙酸合成酶（5-aminolevulinic acid synthase,ALAS）hemA基因,通过对基因的序列分析,发现来自放射形土壤杆菌的hemA基因属于一个新的基因,而来自类球红细菌的hemA基因第335位的氨基酸发生了突变。 2) 分别构建了含放射形土壤杆菌和类球红细菌hemA基因的多个表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过对胞外5-氨基乙酰丙酸产量和5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力进行比较,发现用来源于放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因所构建的重组菌E.coli BL21（DE3）（pET28-A.R-hemA）具有最高的ALA产量和ALAS活力。 3) 研究了重组菌E coli BL21（DE3）（pET28-A.R-hemA）的摇瓶发酵条件。考察了初始葡萄糖浓度、溶氧、温度、前体及抑制剂对重组菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的影响,确定了最佳的诱导条件和培养条件。在最适发酵条件下,重组菌E.coliBL21（DE3）（pET28-A.R-hemA）摇瓶发酵的5-氨基乙酰丙酸的产量可达1.3g/L,比优化前（没加前体）提高了16.2倍。 4) 利用5L的发酵罐进行工程菌培养生产5-氨基乙酰丙酸的研究,对影响产物产量的因素,如:初始葡萄糖浓度、溶氧、pH值、培养方式进行了考察,在优化条件下,发酵罐中的5-氨基乙酰丙酸的产量可达到3.1g/L,比摇瓶发酵提高了238.5%。以5L发酵罐分批发酵的实验数据为依据,对5-氨基乙酰丙酸发酵动力学进行了研究,分别建立了菌体生长、底物消耗和产物生产的非结构模型。该模型能较好的反映5-氨基乙酰丙酸的分批发酵过程。 5) 针对目标产物ALA非蛋白质,外源基因所表达的产物ALA合成酶只是催化ALA合成的催化剂的特点,提出了基因工程菌培养时必需提高产量酶的催化活性而不是翻译得到的更多蛋白质的观点,并采用了较弱的诱导剂乳糖代替价格昂贵而且有毒的强诱导剂异丙基-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）的新方法进行ALA合成酶的诱导表达。在发酵罐分批培养中,胞外5-氨基乙酰丙酸的产量和ALA合成酶的比活力分别提高了43%和15%。 6) 为了有利于ALA的分离和降低生产成本,采用了以D-葡萄糖代替乙酰丙酸作为ALA脱水酶的抑制剂的方法,通过合适的流加策略使胞外ALA的产量提高到了3.1g/L。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 ALA在农业、医学等领域的应用价值与前景展望
• 1.2.1 农业上的用途及作用机理
• 1.2.1.1 新型绿色除草剂
• 1.2.1.2 植物生长调节剂
• 1.2.1.3 无公害杀虫剂
• 1.2.2 医学领域的应用价值
• 1.3 5-氨基乙酰丙酸的稳定性
• 1.4 生物合成5-氨基乙酰丙酸的机理
• 1.4.1 碳四途径（Sheminpathway）ALA合成的调节机制
• 1.4.2 碳五途径（C5pathway）ALA合成的调节机制
• 1.4 生产5-氨基乙酰丙酸的方法
• 1.4.1 化学方法合成ALA
• 1.4.1.1 以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺
• 1.4.1.2 以吡啶，糠醛等杂环物质的衍生物为反应原料
• 1.4.1.3 以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺
• 1.4.2 生物法合成ALA
• 1.4.2.1 诱变育种法
• 1.4.2.2 基因工程菌生产ALA
• 1.5 重组大肠杆菌高密度培养概述
• 1.5.1 影响重组大肠杆菌的高密度培养因素
• 1.5.1.1 宿主菌特性
• 1.5.1.2 表达基因的调控
• 1.6 重组大肠杆菌分批发酵动力学研究进展
• 1.6.1 微生物发酵培养中的结构模型
• 1.6.2 微生物发酵培养中的非结构模型
• 1.7 本课题拟研究的内容
• 参考文献
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 工具酶及试剂盒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.3.1 大肠杆菌培养
• 2.1.3.2 放射形土壤杆菌的培养
• 2.1.3.3 类球红细菌的培养
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子克隆相关实验
• 2.2.2 A．radiobacterzju-0121基因组的提取
• 2.2.3 大肠杆菌菌体浓度测定
• 2.2.4 大肠杆菌菌体干重测定
• 2.2.5 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取
• 2.2.6 蛋白浓度测定
• 2.2.7 SDS-PAGE电泳
• 2.2.8 还原糖浓度测定
• 2.2.9 葡萄糖浓度的测定
• 2.2.10 ALA合成酶比活性的测定
• 2.2.11 发酵液中有机酸的测定
• 2.3 5-氨基乙酰丙酸的分析方法
• 2.3.1 化学显色法
• 2.3.2 反相高效液相色谱柱前衍生法
• 2.3.2.1 反应试剂配制
• 2.3.2.2 样品的制备
• 2.3.2.3 衍生方法的确定
• 2.3.2.4 色谱条件的确定
• 2.3.2.5 标准曲线的绘制
• 2.3.2.6 样品测试、与分光光度法的比较、回收率检测
• 2.3.2.7 方法重现性
• 参考文献
• 第三章 含5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的重组菌的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 质粒
• 3.2.2 菌株和培养基
• 3.2.3 酶和试剂盒
• 3.2.4 质粒提取和转化
• 3.2.4.1 质粒抽提
• 3.2.4.2 感受态细胞的制备和质粒转化
• 3.2.5 5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS）基因的克隆与重组质粒的构建
• 3.2.5.1 放射形土壤杆菌与类球红细菌基因组的提取
• 3.2.5.2 聚合酶链式反应获得5-氨基乙酰丙酸合成酶的基因
• 3.2.6 菌体培养及酶蛋白表达
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 5-氨基乙酰丙酸合成酶的序列分析
• 3.3.2 宿主细胞及质粒选择的原则
• 3.3.3 融合His．Tag对来源于类球红细菌的hemA基因表达ALAS和ALA合成的影响
• 3.3.4 来源于A．radiobacter和R．sphaeroides的hemA基因对重组菌ALAS和ALA合成的影响
• 3.3.5 质粒和宿主细胞对来源于A．radiobacr的hemA基因表达的影响
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 重组菌生产5-氨基乙酰丙酸发酵条件的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 重组菌E．coli BL21（DE3） （pE728-A．R-hemA）的培养
• 4.2.1.2 试剂
• 4.2.1.3 实验仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 表达条件的优化
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 培养基的优化
• 4.3.2 诱导条件的选择
• 4.3.2.1 诱导时机的选择
• 4.3.2.2 诱导剂浓度
• 4.3.2.3 诱导温度
• 4.3.2.4 诱导后的发酵时间
• 4.3.3 正交实验
• 4.3.4 前体添加量的优化
• 4.3.4.1 添加甘氨酸对菌体生长和ALA合成的影响
• 4.3.4.2 琥珀酸的添加量对菌体生长和ALA合成的影响
• 4.3.4.3 钠离子对菌体生长和胞外ALA积累的影响
• 4.3.5 摇瓶装液量对菌体生长和ALA合成的影响
• 4.3.6 初始葡萄糖浓度对ALA产量的影响
• 4.3.7 ALA脱水酶抑制剂对工程菌生长和ALA合成的影响
• 4.3.7.1 乙酰丙酸对工程菌生长和ALA合成的影响
• 4.3.7.2 D-葡萄糖对工程菌生长和ALA合成的影响
• 4.3.8 乳糖作为诱导剂对ALA合成酶表达及ALA合成的影响
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 5-氨基乙酰丙酸的发酵放大及其动力学研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 种子培养基
• 5.2.3 发酵培养基
• 5.2.4 培养条件
• 5.2.4.1 种子培养条件
• 5.2.4.2 摇瓶发酵培养条件
• 5.2.4.3 发酵罐分批发酵条件
• 5.2.5 分析方法
• 5.2.6 实验主要仪器
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 影响重组菌罐上培养的各因素的优化
• 5.3.1.1 pH值对发酵过程中菌体生长和ALA合成的影响
• 5.3.1.2 葡萄糖浓度对发酵过程中菌体生长和ALA合成的影响
• 5.3.1.3 溶氧对发酵过程中菌体生长和ALA合成的影响
• 5.3.2 5-氨基乙酰丙酸分批发酵动力学
• 5.3.3 重组菌的分批补料培养产ALA的研究
• 5.3.3.1 ALA合成前体分批补料培养
• 5.3.3.2 氮源影响及葡萄糖和甘氨酸分批补料及流加培养
• 5.4 小结
• 参考文献
• 第六章 发酵液中5-氨基乙酰丙酸稳定性的研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.3 实验设备
• 6.3 实验结果与讨论
• 6.3.1 发酵液中不同ALA初始浓度的稳定性研究
• 6.3.2 温度对发酵液中ALA稳定性的影响
• 6.3.3 pH值对ALA稳定性的影响
• 6.3.4 溶氧对ALA稳定性的影响
• 6.3.5 光强对ALA稳定性的影响
• 6.4 小结
• 参考文献
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢