Beta-胡萝卜素对人膀胱癌细胞株T24细胞生物学行为的影响及其分子生物学机制的实验研究

论文摘要

研究背景:膀胱癌是我国泌尿系统最常见的肿瘤,其中移行细胞癌（BTCC）占95%以上,严重危害人民健康。近年来我国部分城市肿瘤发病率报告显示,BTCC发病率有增高的趋势。膀胱癌术后并行膀胱内灌注化疗或免疫治疗后仍容易复发,复发率高达50%～70%,其中10%～15%的病例恶性程度增高,易发展为浸润性膀胱癌。因此探索膀胱癌有效治疗的新方法已经成为临床上迫切需要解决的实际问题,而且一直是研究的热点与难点。β-胡萝卜素是一类广泛存在于植物中的共轭多烯类化合物,人体内β-胡萝卜素主要来源于果蔬。既往实验已经证实β-胡萝卜素既无急性毒性又无慢性毒性,同时也无诱变畸形及癌变等特性。近年来越来越多的研究证实,高膳食β-胡萝卜素摄入可降低癌症危险性,同时对β-胡萝卜素的体外研究也证实了其抗肿瘤作用。细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication,GJIC）是细胞间近距离信号传递的主要方式,调控细胞的新陈代谢、增殖、分化等生理过程,对机体的代谢平衡及生长发育有重要意义。研究表明,细胞间隙连接通讯异常与癌的发生发展密切相关。GJIC异常几乎存在于所有的实体肿瘤组织,表现为癌细胞间或/和癌细胞与正常细胞间信息传递受阻。因此在肿瘤的发生发展过程中,GJIC功能被抑制,同时传递细胞增殖和凋亡的调控信号失控,导致细胞过度增殖并异常分化,在受到有害因素作用时极易发生恶变,最终可形成肿瘤。抗肿瘤药物可通过诱导肿瘤细胞凋亡和恢复GJIC的功能来抑制肿瘤细胞的生长。β-胡萝卜素在防癌抗癌中发挥着重要的作用,我们通过体外实验研究β-胡萝卜素对人膀胱癌T24细胞的抑瘤作用,并从诱导细胞凋亡、调控GJIC等方面对其作用机理进行较深入的研究,为BTCC的治疗提供新的思路。目的:探讨Cx43,Bcl-2及Bax在BTCC中的表达及其意义方法:用半定量RT-PCR的方法检测Cx43,Bcl-2及Bax在35例BTCC和21例癌旁组织中的表达情况,并分析其与BTCC临床病理因素的关系。同时取正常膀胱组织15例做对照。结果:膀胱癌组织中Cx43mRNA的表达比值（Cx43/β-actin）为0.341±0.367,明显低于膀胱癌癌旁组织中的0.787±0.697和正常膀胱组织的0.806±0.466（P<0.01）;Bcl-2 mRNA表达比值为0.345±0.430,明显高于癌旁组织中的0.160±0.334和正常膀胱组织的0.145±0.225（P<0.01）。癌旁组织与正常膀胱组织比较,Cx43mRNA及Bcl-2 mRNA的表达比值均无明显差异（p>0.05）。Cx43mRNA的表达水平与BTCC的病理分级呈显著负相关,Cx43mRNA在G3的表达为0.297±0.161,G2的表达为0.538±0.215,G1的表达为0.602±0.254,两组之间比较有统计学差异（P<0.05）。Bcl-2 mRNA的表达水平与BTCC的病理分级正相关,Bcl-2 mRNA在G3的表达为0.472±0.149,G2的表达为0.352±0.113,G1的表达为0.237±0.104,两组之间比较有统计学差异（P<0.05）。复发膀胱癌组织中Bcl-2 mRNA的表达水平（0.401±0.148）高于初发癌组织（0.275±0.109）（P<0.05）。两者均与患者的性别、年龄、肿瘤临床分期、肿瘤直径和肿瘤数目多少等均无相关性（P>0.05）。Bax mRNA在膀胱癌组织,癌旁组织及正常膀胱组织中的表达无明显差异（P>0.05）。Bax mRNA与BTCC临床及病理诸多因素比较,Bax mRNA的表达水平与BTCC患者的性别、年龄、肿瘤临床分期、病理分级,肿瘤直径和肿瘤数目多少,以及肿瘤有无复发等均无相关性（P>0.05）结论:1.BTCC组织中Cx43的表达低于癌旁组织和正常膀胱组织,Bcl-2表达明显增加,Bax的表达在三者之间无明显差异;2.Cx43的表达高低与BTCC的肿瘤病理分级明显相关,呈正相关;Bcl-2的表达也与BTCC的肿瘤病理分级明显相关,呈负相关,而且复发膀胱癌明显高于初发肿瘤,Bax的表达与BTCC的肿瘤病理分级,临床分期无关。目的:探讨β-胡萝卜素对人膀胱癌T24细胞生物学行为的影响,即细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法:设定不同浓度的β-胡萝卜素作用于T24细胞,利用MTT法检测细胞增殖,Hochest染色、流式细胞术检测T24细胞的凋亡指数。结果:MTT法检测β-胡萝卜素（1uM,5uM,10uM,20uM）作用于T24细胞72h后,对T24细胞的抑制率分别为0.41%,6.32%,28.83%,63.02%,其中10uM和20uM组与对照组比较有统计学意义,并且呈明显的剂量效应关系（P<0.05）。Hochest染色可见到不同程度的凋亡细胞,低剂量β-胡萝卜素（5uM）处理细胞后,细胞凋亡极少,增加β-胡萝卜素剂量（10uM,20uM）,细胞凋亡明显增多,并且可见凋亡小体形成。流式细胞术检测其凋亡率,对照组的凋亡率是（0.013±0.006）%,β-胡萝卜素处理5uM组的凋亡率是（0.065±0.018）%,10uM处理组的凋亡率是（0.126±0.022）%,20uM处理组的凋亡率是（0.190±0.024）%;各浓度组与对照组的细胞凋亡率相比差异性显著（P≤0.01）,随β-胡萝卜素浓度增加,细胞的凋亡率增大,呈剂量依赖性关系（P=0.002）。结论:1.β-胡萝卜素作用于T24细胞后,对T24细胞的生长有明显抑制作用,并且呈明显的剂量效应关系2.β-胡萝卜素作用于T24细胞后,明显诱导细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。目的:探讨β-胡萝卜素抑制人膀胱癌T24细胞的分子生物学机制。方法:设定不同浓度的β-胡萝卜素作用于T24细胞,半定量RT-PCR检测T24细胞的Bcl-2、Bax、Cx43mRNA的变化,Western blot检测Bcl-2、Bax、Cx43蛋白的表达。结果:半定量RT-PCR检测,Bcl-2 mRNA表达比值（Bcl-2/β-actin）分别为,5uM组:0.623±0.045,10uM组:0.443±0.045,20uM组:0.193±0.031,对照组:0.670±0.050。与对照组比较,中高剂量组（10uM,20uM）则表达下调,并且呈剂量依赖关系（P<0.01）;Cx43mRNA表达比值分别为,5uM组:0.290±0.050,10uM组:0.443±0.050,20uM组:0.647±0.055,对照组:0.243±0.025。中高剂量组（10uM,20uM）Cx43基因的表达明显上调,并且呈剂量依赖关系（P<0.01）;BaxmRNA的表达有上调趋势,但与对照组比较,无明显差异（P>0.05）。Western blot检测,Bcl-2基因在蛋白表达水平上随β-胡萝卜素浓度的增高表达逐渐下降,并且呈剂量效应关系,各组细胞Bcl-2蛋白表达比值分别为,0uM组:0.982±0.157,10uM:0.441±0.038,20uM:0.152±0.037,10uM及20uM组明显低于对照组（P<0.01）,10uM及20uM组间比较有显著性差异（P=0.01）;Cx43基因在蛋白表达水平上随β-胡萝卜素浓度的增高而增高,并且呈剂量效应关系。各组细胞Cx43蛋白表达比值,10uM组为0.217±0.026,20uM组为0.416±0.048,与0uM组（0.133±0.322）比较有显著性差异（P<0.05）,10uM及20uM组间比较有显著性差异（P=0.01）;Bax基因在蛋白表达水平上与β-胡萝卜素各浓度组有上调趋势,但无统计学差异（P>0.05）。结论:1.β-胡萝卜素作用于T24细胞后,下调Bcl-2基因的表达,Bax无明显改变,Bcl-2/Bax的表达下调,并且与β-胡萝卜素呈明显的剂量效应关系。2.β-胡萝卜素作用于T24细胞后,上调连接蛋白的表达,促进细胞间隙连接通讯功能,并且与β-胡萝卜素呈明显的剂量效应关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 人膀胱移行细胞癌中Cx43,Bcl-2和Bax的表达及其相关性的研究
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 第二章 β-胡萝卜素对人膀胱癌T24细胞生物学行为影响的实验研究
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 第三章 β-胡萝卜素抑制人膀胱癌T24细胞分子生物学机制的实验研究
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况