栽培稻miRNAs及其启动子的ECOTILLING分析

论文摘要

TILLING技术在鉴别自然存在的突变体有巨大潜力。本研究立足于改良较高通量的TILLING检测技术,以粳稻品种日本晴为参照,对95份栽培稻品种的miRNAs及其启动子序列进行扫描,力图获得与水稻主要农艺性状特别是抗旱性相关的等位基因。主要结果如下:1、根据抗旱性强弱,从148份栽培稻中选出92份材料,加上3份深水稻,合计95份材料进行TILLING分析;从392个标记中筛选获得多态性标记128个（30个InDels、28个SSRs、70个miRNAs）;利用InDels和SSRs标记分别对上述供试材料进行聚类分析,结果一致,均聚成籼粳两大类;利用miRNAs标记对95份材料进行聚类分析发现除聚成籼粳两大类外,S2、120、173、175、199五个材料区别于籼粳亚种,自成一类;2、摸索了CELⅠ酶的粗提方法并对CELⅠ酶粗提物的活性检测进行了研究。错配切割实验表明,CELⅠ酶能有效地对大于1 Kb的产物进行准确特异的切割,并可以通过琼脂糖凝胶电泳获得直观的检测结果;对TILLING检测技术进行了改良,省略了酶切终止反应和纯化步骤,并在3%琼脂糖凝胶直接分离TILLING检测产物,该研究结果对于建立简易而又有效的点突变检测方法具有重要的意义;3、根据269个已公布的miRNA序列信息,设计了210对miRNAs引物,TILLING扫描检测到在日本晴和95份材料间表现多态性的miRNAs标记70个;对70个miRNAs标记与供试材料在正常水份与胁迫条件下主要农艺性状（穗长、有效穗、单株有效穗、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率、百粒重、经济学产量、生物学产量、抗旱级别、相对结实率）进行关联分析,结果表明:在两种水份条件下,miR439e与穗长关联,miR159c与单株有效穗关联,miR413与百粒重关联,miR156f1、miR159c、miR435与生物学产量关联,贡献率9.58%-32.51%;miR156d、miR159f,miR167c、miR319b、miR393b、miR415、miR819k同时与抗旱级别关联,贡献率13.80%-26.88%;miR156a和miR415与相对结实率关联,贡献率为10.47%和9.07%;4、对部分与性状表型有关联的几个miRNA的启动子进行了测序,结果显示:miRNA启动子序列与日本晴序列同源性平均达95%（92%-98%）,均含有启动子区域的特征元件TATA box或GC box。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1.前言
• 1.1.TILLING技术与ECOTILLING技术
• 1.1.1.TILLING技术的基本原理及其操作流程
• 1.1.2.TILLING技术的核心与特点
• 1.1.3.ECOTILLING技术
• 1.1.4.（ECO）TILLING技术的应用
• 1.1.4.1.在功能基因组学的应用
• 1.1.4.2.在突变研究筛选的应用
• 1.1.4.3.在资源分析中的应用
• 1.1.4.4.在分子标记辅助育种中的应用
• 1.2.miRNAs
• 1.3.启动子
• 1.4.本研究的目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1.实验材料
• 2.2.实验方法
• 2.2.1.田间试验及性状调查
• 2.2.2.DNA抽提
• 2.2.3.SSR和InDel标记的PCR反应体系及产物分离
• 2.2.4.TILLING技术的PCR反应体系及后期处理
• 2.2.5.CEL Ⅰ酶的粗提
• 2.2.5.1.材料
• 2.2.5.2.透析袋处理
• 2.2.5.3.CEL Ⅰ酶的粗提
• 2.2.6.分子标记检测
• 2.2.6.1.SSR标记
• 2.2.6.2.InDel标记
• 2.2.6.3.miRNA序列下载和引物设计
• 2.2.7.数据分析
• 2.2.8.点突变测序及测序结果分析
• 2.2.9.生物信息学分析
• 3.结果与分析
• 3.1.栽培稻品种的选取
• 3.1.1.材料间遗传多样性分析
• 3.2.CEL Ⅰ酶的提取与TILLING高通量方法的改良
• 3.2.1.CEL Ⅰ酶的提取
• 3.2.2.TILLING高通量方法的改良
• 3.3.miRNA及其启动子的ECOTILLING扫描
• 3.3.1.正常水分处理下miRNA及其启动子与性状的关联分析
• 3.3.2.水分胁迫处理下miRNA及其启动子与性状的关联分析
• 3.3.3.miRNA及其启动子与抗旱级别、相对结实率的关联分析
• 3.4.与性状关联的miRNA及其启动子的多态性分析
• 3.4.1.与性状关联的miRNA的序列分析
• 3.4.2.与性状关联的miRNA的启动子序列分析
• 4.讨论
• 4.1.CEL Ⅰ提取的注意事项和TILLING高通量平台的改良
• 4.2.关联分析与启动子序列分析
• 4.3.检验出来的突变下一步如何应用
• 参考文献
• 附录
• 致谢